【关键词】 移植
关键词: 移植，自体;静脉/移植;细胞外基质;平滑肌细胞;狭窄
摘 要:目的 观察胶原和弹性纤维的积累及其与自体移植静脉（autologous vein grafts，AVG）狭窄的关系. 方法 建立兔自体颈外静脉移植模型，用计算机图像分析，测量胶原和弹性纤维在新生内膜的面积以及Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白表达灰度值. 结果 移植后2～12wk胶原和弹性纤维面积逐渐增加，Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白表达也逐渐增强. 结论 静脉移植后胶原和弹性纤维逐渐积累，其含量与管腔减少正相关，胶原在管腔中的作用大于弹性纤维，胶原蛋白中Ⅰ型胶原作用大于Ⅲ型胶原.
Keywords:transplanlation，autologous;veins/transplanta-tion;extracellular matrix;smooth muslce cell;stenosis
Abstract:AIM To observe the accumulation of collagen and elastin fibres and its correlation with（autologous vein grafts，AVG）cavity loss.METHODS To establish the rabbit mod-el of AVG，the area of collagen and elastin fibres and the ex-pression of collagenⅠand collagenⅢwere assayed quantita-tively in neointima.RESULTS Area of collagen and elastin fibres increased gradually;the percentages of two fibres in in-timal area were correlated positively with the cavity loss rate of the AVG during4～12weeks after implantation.The ex-pression of collagenⅠand collagenⅢalso increased.CON┐CLUSION Collagen and elastin fibres accumulate gradually and play a critical role in the cavity loss of the AVG.Colla-gen is more important than elastin fibres，and collagenⅠplays the main part.
0 引言
细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在动脉内膜增生和狭窄中的作用近年倍受重视，既参与平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）增殖和迁移，还参与血管壁重塑.但在自体移植静脉（autologous vein grafts，AVG）内膜增生和狭窄中的作用了解甚少，而且结果不尽相同［1，2］ .我们通过对胶原，弹性纤维面积和Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白（ColⅠ，ColⅢ）表达的定量分析，了解ECM的分泌情况，及其与AVG内膜增生和管腔减小的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 新西兰兔，体质量2.2～2.5kg，戊巴比妥钠麻醉（30mg kg-1 ），颈正中切口，取左颈外静脉约3.0cm，生理盐水（含肝素5000U L-1 ，罂粟碱0.6g L-1 ）冲洗管腔并保存.用内径2.1mm“Cuff”将倒转的静脉桥与左颈总动脉端端吻合［3］ ，送动物实验中心喂养.动物随机分为6组，每组5只，分别于移植前，移植后3d，1，2，4，8和12wk取血管桥.
1.2 方法 以40g L-1 多聚甲醛加压灌注，使其直径维持在取标本前水平并固定，包埋.常规HE，Masson，维多利亚蓝-丽春红染色.切片脱蜡至水，h3 O2 甲醇封闭，微波修复，胰酶消化，滴加一抗（50mL L-1 正常羊血清稀释，均为1 50，鼠抗人ColⅠ单克隆抗体购自北京中山生物技术公司，鼠抗人ColⅢ单克隆抗体为本校病理学教研室提供），4℃过夜，加生物素化二抗（1 100羊抗鼠抗体），加SABC复合物（购自博士德生物工程公司），DAB显色，脱水，透明，封片.每只动物各选取1张切片，显微镜下（20×5倍）随机选取4个不同部位.在HE染色切片上测移植前静脉中膜面积，移植后不同时间外弹力膜以内面积和管腔面积.在维多利亚蓝-丽春红和Masson染色切片上分别测量新生内膜中弹性和胶原纤维面积.ColⅠ，ColⅢ免疫组化表达灰度值以同样方式测量.
用外弹力膜以内面积减去移植前静脉中膜面积作为AVG管腔减小前的相对最大面积计算管腔相对丧失率，管腔相对丧失率=（1-管腔面积/管腔最大面积）×100%.
将4～12wk各时间点AVG管腔相对丧失率与弹性，胶原纤维百分比和两种纤维总量百分比分别作相关分析，并进行管腔相对丧失率随胶原和弹性纤维面积百分比变化的多重回归分析.
统计学分析:各组数据x ±s表示，组间进行t检验，P&<0.05为差异显著.
2 结果
2.1 新生内膜弹性和胶原纤维面积测量 维多利亚蓝-丽春红染色中弹性纤维为蓝色，胶原纤维为红色，SMC为黄色.Masson染色中胶原纤维为蓝色，SMC为红色.新生内膜形成后，弹性纤维占内膜面积的百分比逐渐升高，12wk为2wk的3.0倍.胶原纤维量也持续增多，12wk为2wk的1.4倍.弹性和胶原纤维面积之和12wk时占内膜面积的（65±16）%（Tab1）.
表1 胶原和弹性纤维占新生内膜面积百分比 略
2.2 新生内膜弹性和胶原纤维变化与管腔相对丧失率相关 4～12wk各时间点AVG管腔相对丧失率分别为:4wk，（8.1±1.6）%;8wk，（11.6±2.4）%;12wk，（14.0±1.9）%.管腔丧失率与胶原和弹性纤维面积及其总面积百分比呈正相关，r=0.859，0.828和0.916，P&<0.01.管腔相对丧失率随胶原和弹性纤维百分比变化的多重回归方程为:Y=4.463+0.197X1 +0.112X2 ，X1 ，X2 对应的P值分别为0.102和0.014，回归方程的方差检验结果为F=30.39，P&<0.0001，X1 为弹性纤维，X2 为胶原 纤维.
2.3 ColⅠ，Ⅲ免疫组化染色 阳性信号位于细胞核外，呈棕黄色细纤维状.2wk时在内膜少量表达，然后逐渐升高，4～8wk增加最明显（8wk vs4wk，P&<0.05），12wk表达进一步增加，各时间点ColⅠ表达均高于ColⅢ（Tab2）.
表2 ColⅠ，Ⅲ在内膜表达的灰度值 略
3 讨论
以往的研究认为，AVG的狭窄是由内膜SMC增殖和迁移引起的，近年研究发现SMC分泌的ECM可能起着同样重要的作用.Schwartz等［4］ 发现动脉扩张后再狭窄病变中ECM体积可达新生内膜的90%左右.Majors等［5］ 进一步证明，在损伤动脉的增生内膜中，ECM主要由胶原纤维组成，其中90%为Ⅰ型和Ⅲ型胶原.ECM在AVG新生内膜中的积累及其与AVG狭窄关系的研究还比较少. 3.1 弹性和胶原蛋白变化在AVG重塑中的作用 Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白免疫组化染色结果显示，Ⅰ型胶原蛋白的表达早于Ⅲ型胶原蛋白，表达量在各时间点也高于Ⅲ型胶原蛋白.Ⅰ型胶原是较成熟的胶原，以纤维形式存在，有很强的张力，Ⅰ型胶原含量决定组织的僵硬度.Ⅲ型胶原是以细纤维形式存在，比Ⅰ型胶原更富有伸展性，因此，Ⅰ，Ⅲ型胶原之间保持适当数量和比例对维持组织正常结构和功能具有重要意义.在高血压大鼠心肌纤维化的研究中发现，在纤维化早期（4wk）Ⅰ/Ⅲ胶原的比值较对照组低，而纤维化晚期（12wk），Ⅰ/Ⅲ型胶原的比值明显较对照组高［6］ .术后远期狭窄的AVG实际上形成了一僵硬的纤维化管道，缺乏对血流的适应性收缩和扩张的能力.我们认为，AVG这一重塑现象与Ⅰ型胶原蛋白的高表达有关，Ⅰ型胶原蛋白的高表达是AVG纤维化的病理基础，抑制Ⅰ型胶原蛋白的分泌，对于改善AVG重塑过程有重要意义.弹性纤维在静脉移植后2wk开始逐渐增加，主要出现在中膜和新生内膜深层，呈斑片状或短纤维状分布.这一分布特点加上总量的增加是高压动脉血流作用的结果.这与弹性纤维在肺动脉高压的肺血管重建过程中的表现相似.在肺动脉高压大鼠模型中［7］ ，肺动脉内弹力层断裂增加，在肥厚的肺动脉中层，弹性蛋白以板层间碎片或“岛屿”样分布，而不是作为弹性蛋白层的增厚出现.另外，生化分析发现肺动脉高压时肺动脉弹性蛋白的代谢率增高，弹性蛋白合成和积累均升高，同时弹性蛋白降解也有所增高，通过合成和降解的调解参与血管壁的重塑.
3.2 弹性和胶原蛋白变化在AVG内膜增生和管腔减小中的作用 胶原纤维面积2wk以后快速增加，12wk时几乎占到新生内膜的一半，Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白的表达也逐渐增高，合成速度加快，推测此时胶原蛋白合成增加而降解减少，使之逐步堆积.弹性纤维面积2wk以后也逐渐增多.静脉移植后发生扩张，4wk以前管腔逐渐扩大，这和外弹力膜周长的变化相一致，4wk以后管腔才逐渐减小［3］ ，因此我们从4wk开始计算AVG的管腔相对丧失率.由于4wk时管腔面积达到最大，且4wk以后外弹力膜周长基本不变，因此我们以血管外弹力膜以内面积作参照，减去移植前静脉中膜面积，作为各AVG相对最大管腔面积来计算管腔相对丧失率.相关分析发现，4～12wk AVG弹性纤维和胶原纤维占内膜面积百分比的变化与AVG的管腔相对丧失率呈明显正相关，两者之和的相关性更强，它们的相关性排列顺序为弹性纤维+胶原纤维?胶原纤维?弹性纤维.多重回归分析中，胶原纤维对应的P值明显小于弹性纤维，说明胶原纤维面积的变化对AVG管腔相对丧失率影响更大.胶原和弹性纤维是ECM最主要组成成分，我们认为ECM，特别是胶原和弹性纤维在AVG管腔减小中有重要作用.这与我们以前的研究结果相一致［3］ ，即静脉移植2wk以后新生内膜细胞密度和增殖指数逐渐下降，面积却仍在持续增加.
参考文献
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