作者：袁建林 王智 武国军 郝晓柯
【关键词】 前列腺特异抗原
关键词: 前列腺特异抗原;单域抗体;克隆;表达
摘 要:目的 扩增出抗前列腺特异抗原（PSA）单克隆抗体（MAb）的重链可变区（VH）单域抗体基因，并在大肠杆菌中表达. 方法 从分泌抗PSA mAb的杂交瘤细胞系E4 B7 中提取总RNA，经RT-PCR扩增VH 单域抗体基因，将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达. 结果 VH 单域抗体基因全长363bp，含起始码和终止码.将其克隆到pGEX-4T-1内，转化大肠杆菌DH5α，获得高效表达，表达量占全菌总蛋白质的38%，以包涵体形式存在.经初步纯化和复性后，用谷胱甘肽（GST）亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗PSA VH 单域抗体.竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性. 结论 构建成功抗PSA的VH 单域抗体，为进一步临床应用奠定基础.
Keywords:prostate-specific antigen;single domain antibody;cloning;expression
Abstract:AIM To amplify the VH single domain gene of an-ti-prostate specific antigen（PSA）monoclonal antibody（mAb），and express it in E.coli.METHODS Total RNA was extracted from the hybridoma cell line E4 B7 ，which se-creted McAb against PSA，and subjected to reverse tran-scription.The VH single domain antibody gene was amplified by PCR，cloned into the prokaryotic fusion protein expres-sion vector pGEX-4T-1and expressed in E.coli.RESULTS The VH single domain antibody gene consisted of363bp，which was cloned into an expression vector pGEX-4T-1and transformed into E.coli DH5α.Clones harboring plasmid pGEX-VH produced a40kDa of fusion protein in E.coli at a level of38%of the total cellular protein.After primary pu-rification and renaturation，the fusion protein was further pu-rified by GST-affinity chromatography.The fusion protein was digested with thrombin and the VH single domain anti-body was separated，the binding activity of anti-PSA VH sin-gle domain antibody was confirmed by competitive binding in-hibition assay in vitro.CONCLUSION Anti-PSA single do-main antibody has been successfully constructed for the use in clinical studies.
0 引言
前列腺特异抗原（Prostate specific antigen）是一种灵敏度较高的前列腺癌肿瘤标志物，131 I标记抗PSA单克隆抗体用于前列腺癌放射免疫显像，有较高的灵敏度和特异性［1］ .针对鼠源性单克隆抗体对人体存在着免疫原性的问题，自20世纪80年代以来基因工程抗体的研究愈来愈受到重视，其中重链可变区（VH ）单域抗体由于只有一个功能区，保留了较好的抗原结合能力，在制备和应用上有其优点.我们应用RT-PCR方法从抗PSA单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4 B7 中扩增出VH 单域抗体基因，在大肠杆菌中获得了高效表达，并进行亲和活性测定.
1 材料和方法
1.1 材料 E.coli DH5α受体菌，本室保存.质粒pUC19和pGEX-4T-1由本校生物化学教研室白玉杰博士惠赠.小鼠杂交瘤细胞系E4 B7 由本室制备，保存并培养.人前列腺癌细胞株PC-3，由北京医科大学病理教研究室从美国引进.反转录试剂盒（Promega）;Rapid DNA Ligation Kit（Boehringer Mannheim）;AdvantageTM PCR-Pure Kit（Clon-Tech）;WizardTM Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）;各种限制性内切酶，核酸分子质量标记物，凝血酶等购自华美公司和Promega公司.PCR引物Heavy Primer1和2:Pharmacia公司产品，是噬菌体呈现系统中的混合引物.设计一对含有EcoRI-起始码和终止码-SalI的VH 引物，上游引物A为:5′-GCGAATTCATGCAGGTCCAACTGCAGGA-3′，下游引物B为:5′-GCGTCGACTTATGAGGA-GACGGTGACCGTGG-3′，该引物在美联（西安）生物公司合成.
1.2 方法
1.2.1 细胞总RNA的提取和逆转录 培养小鼠杂交瘤细胞E4 B7 ，至对数生长期.收集细胞2×107 个，提取细胞总RNA［2］ ，逆转录反应按Reverse Tran-scription system，USA Promega说明书进行.
1.2.2 VH 基因的PCR扩增 采用PE公司2400型扩增仪进行反应，第一轮PCR应用引物Heavy Primer1和2，扩增条件是先94℃预变性5min，后按94℃60s，55℃90s，72℃120s进行30个循环后，继续在72℃延伸10min.取5μL PCR产物进行15g L-1 琼脂糖凝胶电泳分析，用AdvantageTM PCR-Pure Kit回收，以回收物为模板，用引物A和B进行第二轮PCR.
1.2.3 VH 基因的克隆及序列分析 按常规克隆技术［3］ ，将PCR产物通过EcoRI和SalI酶切位点克隆入pUC19质粒，挑选阳性克隆pUC19-VH .使用Wiz-ardTM Plus Minipreps DNA Purification System纯化重组质粒后，PE公司373A DNA Sequencer通过Dye Primer反应进行测序.将VH基因序列输入计算机与Internet网中GenBank已知基因进行同源性比较.
1.2.4 VH基因的表达及纯化 将已测序的VH 基因克隆入pGEX-4T-1质粒，挑选阳性克隆pGEX-4T-1/VH ，培养重组表达质粒pGEX-4T-1/VH 转化的JM109细胞，加入IPTG至终浓度为0.1mmol L-1 ，诱导表达GST-VH 融合蛋白，以120g kg-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察表达结果.表达产物进行纯化［4］ ，得到纯化的VH 单域抗体蛋白.
1.2.5 结合活性的测定 5×105 个PC-3细胞经含2g kg-1 NaN3 ，0.01mol L-1 pH7.4PBS洗涤二次 后，加入纯化的VH 单域抗体（10mg L-1 ），4℃保温30min后，加入FITC标记的抗PSA单克隆抗体4℃保温30min，冰冷PBS洗涤，10mg L-1 多聚甲醛固定，流式细胞仪测定标记荧光细胞的百分率.同时设立抗PSA单克隆抗体作为阳性对照，抗AFP单克隆抗体作为无关抗体对照.
2.1 VH 基因的扩增 以E4 B7 cDNA为模板进行PCR扩增，得到一条大小约为370bp的DNA片段（Fig1），与预期鼠抗体VH 基因大小一致.
图1 略
2.2 VH 基因的克隆及序列分析 PCR产物克隆入pUC19质粒，随机挑取克隆，提取质粒DNA，经EcoRI，SalI双酶切鉴定，结果重组质粒pUC19-VH 可得到370bp大小的VH插入片段（Fig2）.将阳性重组质粒pUC19-VH 测序，结果表明:VH 单域抗体基因由363bp组成，在两端含有EcoRI-起始码和终止码-SalI，编码121个氨基酸，第23，96位氨基酸为抗体可变区特征性的半胱氨酸，其全部碱基组成及推测的相应氨基酸见Fig3.VH 基因输入计算机与Internet网中GenBank已知基因比较，未查到相同基因.基因序列同源性分析表明:与鼠免疫球蛋白重链可变区基因h320-22VH 同源性最高（Score494）.
图2 － 图3 略
2.3 VH 基因的表达 含有VH 单域抗体基因表达质粒的E.coli DH5α，经终浓度为0.1mmol L-1 的IPTG诱导表达5h后，取菌体以120g kg-1 SDS-PAGE分析，可见一条Mr 约39000的新生蛋白带，与GST相对分子质量（26000）和单域抗体相对分子质量（13000）之和相近.挑选的4个阳性克隆菌种皆有表达（Fig4）.薄层扫描结果可见，表达量占菌体总蛋白的38.046%.
图4 略
2.4 VH 单域抗体结合活性的测定 纯化后的VH 单域抗体产物经免疫荧光竞争实验，流式细胞仪测定，显示VH 单域抗体封闭靶细胞PC-3后，再加亲体抗体，其细胞荧光标记率大大降低.荧光标记细胞的阳性率:无关抗体为3.2%，VH 单域抗体封闭后再加亲本抗体为48%，单纯亲本抗体96.4%，说明VH 单域抗体能与靶细胞发生特异性结合.
3 讨论
基因工程抗体技术的出现，使人们可以按照需要对鼠单抗进行改造，构建单链抗体，嵌合抗体，人源化抗体等［5-9］ .一般认为，在抗原结合部位中，VH 的作用比轻链可变区（VL ）大，大多数单独的VH 保留了较好的抗原结合能力和专一性，VL 没有抗原结合的能力.所以，目前有关VH 单域抗体的报道较多［10］ .Cai等
［11］ 从抗黑色素瘤单链抗体噬菌体库中得到的一株V86抗黑色素瘤VH 单域抗体，对黑色素瘤细胞的亲和活性远超过单链抗体，显示出较好的应用前景.
我们从一株分泌抗PSA单克隆抗体的杂交瘤细胞的总RNA中，通过RT-PCR技术获得了VH 基因，并在VH 基因的两端加上了起始码和终止码，构建了完整的VH 单域抗体基因，并在大肠杆菌中高效表达了VH 单域抗体的融合蛋白，经常规变性复性方法，获得了纯化的VH 单域抗体，在免疫荧光竞争结合实验中证实了该抗体可与前列腺癌细胞特异性结合，但结合力较低.一些VH 单域抗体由于暴露了原先和VL结合的疏水性，可使其结合力降低，通过使抗体的决定簇互补区（CDR）碱基随机突变，可以将抗体的结合力提高数十到数百倍［12］ .我们可以通过此方法提高获得的VH 单域抗体的亲和活性，为进一步的动物体内实验及临床应用奠定基础［13-15］ .
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