【关键词】 葛根素
关键词: 葛根素;脊髓;缺血再灌注损伤;兔
摘 要:目的 研究葛根素对兔脊髓缺血再灌注损伤的作用. 方法 20只雄性新西兰大白兔随机分成缺血组（A组，n=10）及葛根素组（B组，n=10），夹闭腹主动脉肾下段20min，建立兔脊髓腰尾段缺血模型.B组于夹闭前10min静脉注射葛根素30mg kg-1 ，A组则静脉注射等容量生理盐水.测定夹闭前、后及再灌注后血浆中丙二醛（MDA）浓度及超氧化物歧化酶（SOD）活性;再灌注4，8，12，24及48h分别对动物后肢运动功能评分;再灌注48h后，处死动物，制作切片，观察其组织病理学变化. 结果 缺血及再灌注后B组MDA值明显低于A组（P&<0.05），而SOD活性明显高于A组（P&<0.05）;再灌注后4，8，12，24及48h时的神经功能评分B组明显高于A组（P&<0.05）;光镜下，与A组相比，B组脊髓组织损伤显著减轻，形态基本正常的前角细胞较多. 结论 葛根素对兔脊髓缺血再灌注损伤有显著的保护作用.
Keywords:puerarin;spinal cord;ischemic and reperfusion injury;rabbit
Abstract:AIM To study the effects of puerarin on spinalcord injury resulting from ischemia and reperfusion.METH┐ODS Twenty male New Zealands white rabbits were ran-domly pided into two groups:ischemia group（Group A，n=10）and puerarin group（Group B，n=10）.The spinal cord ischemia rabbit model was made by occluding infrarenal abdominal aorta for20min.In Group B，puerarin30mg kg-1 was administered intravenously10min before clamping.In Group A，9g L-1 saline was used as Group B.The productions of MDA and the activities of SOD before，during and after cross-clamping were assayed.Neurologic status was scored at4，8，12，24，48hours after reperfusion.All animal were killed48h after reperfusion，the spinal cords were studied histopathologically.RESULTS During and af-ter cross-clamping，the productions of MDA in Group B were lower than those in Group A（P&<0.05），but the activities of SOD in Group B were higher than those in Group A（P&<0.05）.Neurologic function scores at4，8，12，24，48h after reperfusion were higher in Group B than those in Group A（P&<0.05）;Compared to Group A，less degree of injury was seen in Group B under optical microscope48h after reperfu┐sion.CONCLUSION Puerarin could protect rabbit spinal cord injury resulting from ischemia and reperfusion.
0 引言
脊髓缺血损伤所致瘫痪是胸腹主动脉手术后的常见并发症，其发生率为4%～38%［1］ ，危害较大.预防性使用某些药物如氯胺酮、硫喷妥钠等有减轻脊髓缺血损伤的作用［2］ ，葛根素是从中药葛根中提取的一种异黄酮单体［3］ ，对心、脑等的缺血损伤有保护作用［3，4］ ，然而对脊髓缺血损伤有无保护作用尚未见报道，我们旨在探讨葛根素对兔脊髓缺血再灌注损伤的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 20只成年雄性新西兰大白兔，体质量2～2.5kg，随机分成两组:缺血组（A组，n=10）及葛根素组（B组，n=10）.B组于腹主动脉夹闭前10min iv葛根素注射液（陕西安康制药厂生产，批号990107）30mg kg
-1 ，A组采用同样方法给予等容量生理盐水作对照.
1.2 方法
1.2.1 动物模型制作 所有新西兰大白兔术前过夜禁食，自由饮水.耳缘静脉注入20g L-1 的戊巴比妥钠20mg kg-1 复合5mL L-1 的异氟醚吸入麻醉，并经耳缘静脉滴注平衡盐液10mL kg-1 h-1 ;无菌操作下分别经耳动脉及股动脉置管以监测心率、近端动脉压及远端动脉压;普鲁卡因局麻开腹，暴露腹主动脉;在肾动脉起点以下0.5～1.0cm处用动脉夹夹闭腹主动脉20min后开放腹主动脉.夹闭腹主动脉前经耳缘静脉给予400U肝素.可调式加热垫置于动物身下，维持兔体温.经兔耳动脉采血监测PaO2 ，PaCO2 及血糖.
1.2.2 MDA含量及SOD活性的测定 分别于夹闭即刻（C0 ）、夹闭20min（C20 ）及再灌注后1h（R1 ）自耳动脉采血2mL，用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.
1.2.3 神经功能评分 在缺血再灌注后4，8，12，24及48h分别对动物后肢运动功能评分.评分标准［5］ :0级，后肢完全瘫痪;1级，后肢有微弱运动;2级，后肢可运动，但不能行走或跳跃;3级，能行走或跳跃，但有明显共济失调;4级，正常.
1.2.4 组织病理学观察 再灌注48h后，用20g L-1 戊巴比妥钠深麻醉动物，以40g L-1 多聚甲醛经心脏灌注固脊髓组织，取腰段脊髓组织（L3 -L7 ）行石蜡包埋，然后切片（4μm），苏木精、伊红染色，光镜下观察.
统计学处理:计量资料以x ±s表示.两组间比较采用t检验;组内比较用方差分析及q检验作统计学处理;神经功能评分的比较用秩和检验.P&<0.05为有显著性差异.
2 结果
2.1 血浆MDA值变化 缺血及再灌注后，A组及B组MDA值较缺血前均升高;但与A组相比，B组MDA值明显降低（P&<0.05，Tab1）.
表1 血浆MDA值变化 略
2.2 血浆SOD活性变化 缺血及再灌注后，A组SOD活性较缺血前明显降低;B组SOD活性较缺血前变化不明显，但与A组相比，却明显升高（P&<0.05，Tab2）.
表2 血浆SOD活性变化 略
表3 术中各生理学参数变化 略
2.3 生理学参数的比较 与A组相比，B组中兔的血压及心率略有降低，但并不明显，各时间点两组间生理学参数的比较没有统计学意义（Tab3）.
2.4 神经功能评分 缺血再灌注后4，8，12，24及48h的神经功能评分显示:B组的神经功能评分明显高于A组（P&<0.05，Tab4）.
表4 再灌注4，8，12，24，48h神经功能评分 略
2.5 组织病理学观察 A组:光镜下显示，腰膨大段脊髓有明显的改变，损伤严重，形态正常的脊髓前角运动神经元细胞稀少，核固缩，部分核发生裂解，神经细胞周围有许多空泡形成（Fig1）.B组:光镜下显示，与A组相比，腰膨大段脊髓组织损伤明显减轻，形态基本正常的脊髓前角运动神经元细胞较多，胞体呈多角形，核仁清晰，可见尼氏体（Fig2）. 图1 － 图2 略
3 讨论
本结果显示:B组再灌注后4，8，12，24及48h时 的神经功能评分明显高于A组;与A组相比，B组脊髓组织损伤减轻，形态基本正常的前角细胞较多.从而表明葛根素对兔脊髓缺血再灌注损伤有明显的保护作用.
腹主动脉夹闭造成脊髓损伤的主要机制为脊髓缺血缺氧，以及继发的病理生理改变，包括:细胞缺氧时细胞膜的通透性增高，Na+ 内流增多使细胞内Na+ 浓度增高，而同时ATP生成减少，以致Na+ -K+ 泵不能充分运转，进一步使细胞内Na+ 浓度增高，促使水进入细胞，导致细胞水肿，血管内皮细胞肿胀可阻塞微血管，加重组织缺氧;夹闭及再灌注后黄嘌呤、次黄嘌呤等ATP代谢产物和黄嘌呤氧化酶（XO）大量生成，产生大量氧自由基［6］ ;脊髓缺血使谷氨酸等兴奋性氨基酸（EAA）释放增多，谷氨酸与脊髓上NMDA受体结合，Ca2+ 大量进入细胞内形成钙超载，导致细胞死亡［7］ .脊髓神经细胞膜含有较多的磷脂和不饱和脂肪酸，自由基的大量产生使脂质过氧化反应加剧，MDA是此反应产物之一，MDA的测定可以反映脂质过氧化的水平，间接反映氧自由基的活性.SOD是催化超氧阴离子歧化反应的酶类，具有保护细胞、对抗氧自由基的侵害，因此，抑制SOD活性的降低亦即增强了内源性氧自由基清除系统的功能.
本结果证明葛根素能够明显降低脊髓缺血及再灌注时血浆MDA值，保护SOD活性，从而表明葛根素能够减弱氧自由基介导的脂质过氧化反应对脊髓的损害，增强机体的抗氧化损害能力.葛根素的临床和实验研究已表明，它除了具有扩张冠状动脉，降低心脏负荷，减少心肌氧耗外［4］ ，还有多种药理学作用，包括:阻止Na+ 的内流，具有Na+ 通道抑制剂的作用［8］ ;拮抗谷氨酸对神经细胞的损伤作用［9］ ;扩张微动脉，改善微循环障碍［10］ .葛根素的上述药理学作用可能都参与了其对脊髓缺血再灌注损伤的保护.兔脊髓缺血再灌注后14～48h出现明显的迟发性瘫痪［11］ ，有研究认为，迟发性瘫痪与脊髓水肿、白细胞浸润及花生四烯酸代谢引起的血管收缩有关［2］ .本实验显示，葛根素组中的兔无一只发生迟发性瘫痪，表明葛根素对兔迟发性瘫痪也有预防作用，其机制可能是葛根素能够减轻脊髓水肿、扩张微动脉、降低氧耗，有利脊髓保持氧供需平衡.兔脊髓缺血再灌注损伤后，其后肢运动功能的恢复程度受多种因素的影响，如:温度、血压、血气、血糖等，本实验中，虽然葛根素组中的兔的血压及心率略有降低，但并不明显，这些因素在两组兔中无统计学差异，因此可以排除这些因素的影响.
综上所述，葛根素对兔脊髓缺血再灌注损伤有明显的保护作用，其机制可能与其抗氧化损害的作用及对缺血再灌注损伤的病理生理的多方面的综合影响有关.
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