关键词: 成纤维细胞;细胞培养
摘 要:目的 探讨来自正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞的生物学特性. 方法 对三种组织均采用组织块法进行细胞的原代培养，采用胰蛋白酶消化传代，分别利用绘制细胞生长曲线，3 H-胸腺嘧啶掺入及3 H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖，DNA合成代谢及胶原合成等情况，并比较它们之间的差异. 结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞在细胞增殖、DNA合成代谢及胶原合成量等方面均明显高于正常皮肤及增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞，后两者之间有一定区别但无统计学意义. 结论 不同组织来源的成纤维细胞其生物学行为亦有所区别，因此在进行实验研究时应有一定的针对性.
Keywords:fibroblasts;cell culture
Abstract:AIM To investigate the biological characteristics of fibroblasts derived from normal human dermal，hyper-trophic scar and keloid tissues.METHODS Fibroblasts pri-mary culture was carried out by the assay of planting tiny tis-sue masses into culture bottles.The fibroblasts，after being isolated from different tissues，were cultivated and the cell growth curves were drawn.Meanwhile，3 H-TdR and3 H-pro-line incorporations were employed to measure the DNA metabolism and collagen synthesis of the cells respectively.RESULTS Keloid fibroblasts had a much more active bio-logical characteristic than that of the other two kinds of fibroblasts.There was a slight difference between the normal dermal fibroblasts and hypertrophic scar ones.CONCLU┐SION Fibroblasts derived from different tissues have their own biological characteristics.This makes it necessary for us to do the research on different tissues with different fibrob-lasts.
0 引言
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩常见于烧伤或皮肤外伤愈后，是机体组织异常修复的结果.在临床上轻者可影响美观，重者可导致邻近器官的功能障碍甚至畸形，这些均直接影响患者的生活质量［1］ .研究证实，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成主要是由于组织在修复过程中成纤维细胞的活动异常增强，从而产生大量的Ⅰ型胶原、蛋白聚糖及纤维粘连蛋白等基质成分并使之沉积所致［2，3］ .对于这种疾病目前临床上尚缺乏有效的治疗手段，实验研究则由于缺乏理想的动物模型而受到很大的限制，因此我们通过该实验初步探讨不同组织来源的成纤维细胞的生物学区别.
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶及胃蛋白酶均购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，3 H-TdR及3 H-脯氨酸购自中科院原子能物理研究所，MTT购自华美生物工程公司.
1.2 方法 正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织均来自外科手术后所切除标本，所培养出的成纤维细胞分别命名为正常皮肤成纤维细胞（normal skin fi-broblast，NsFb）、增生性瘢痕成纤维细胞（hyper-trophic scar fibroblast，HTsFb）及瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblast，KFb）.标本剪去表皮及皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块（0.5mm×0.5mm×0.5mm），接种于25mL培养瓶中，37.0℃，50mL L-1 CO2 孵箱中孵育4～6h后加入含100mL L-1 小牛血清的DMEM培养基，继续培养，2～3d换液1次，待细胞长出后即为原代成纤维细胞.当原代成纤维细胞达到80%～90%融合时，用2.5g L-1 胰蛋白酶消化收集细胞，用含10mL L-1 小牛血清的DMEM重悬细胞，按1 3传代，实验用第3～6代. 1.3 观测指标 ①细胞增殖.计数法:将三种细胞取相同代数并于其对数生长期时同时消化并制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×106 L-1 ，将细胞按1mL/孔接种48孔培养板，每种细胞设1个复孔，共设12组.置孵箱培养24h后以2.5g L-1 胰蛋白酶消化第一组细胞并以胎盼蓝做活细胞染色，在镜下计数，此后每日于相同时间点连续测量12d，依所得数据绘制细胞数-时间的细胞生长曲线.四唑盐（MTT）比色法:同上法接种细胞并于24h后将第一组细胞每孔加入80μL MTT（20g L-1 ），继续孵育4h后弃去上清，再每孔加入0.5mL二甲基亚砜，振荡30min后选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定个孔的吸光度，此后每日于相同时间点连续测量12d并绘制吸光度值-时间的细胞生长曲线.②细胞DNA合成的测定.胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，为DNA合成所必需，因此用同位素3 H标记TdR即3 H-TdR作为DNA合成的前体能掺入其合成代谢过程，通过检测细胞放射性强度可以反映出细胞DNA的代谢情况.接种细胞于48孔板，每种细胞设8个复孔，每孔细胞数为1×104 ，于接种后24h换液并每孔加入1μci3 H-TdR，继续培养12h后弃培养基，用37℃PBS缓冲液冲洗培养板10次，风干后每孔加入2mol L-1 NaOh300μL，室温放置30min，镜下观察细胞完全溶解后将各孔溶液分别收集于纤维滤纸上，于Beckman LS-6500型液闪计数仪上测定cpm值.③细胞胶原合成的测定.脯氨酸是成纤维细胞合成胶原所必需的氨基酸之一，因此3 H-脯氨酸作为胶原合成的前体能掺入其合成代谢过程.同上法接种细胞于48孔板，于接种后12h换液，继续孵育24h后进行3 H-脯氨酸掺入:配制β-氨基丙腈，L-维生素C，3 H-脯氨酸混合液，终浓度分别为100g L-1 ，50g L-1 ，10ci L-1 ，按每孔100μL进行掺入，孵育24h后收集并进行cpm值测定.统计学处理:数据以x ±s表示，应用Origin软件进行组间t检验.
2 结果
2.1 原代成纤维细胞的生长 结果表明，KFb游出组织块的速度明显快于NsFb及HTsFb（P&<0.05）;在细胞的生长方面也以KFb为最快，NsFb次之，HTsFb最慢（Fig1～3）.
图1 －图3 略
2.2 细胞的增殖 细胞记数法与MTT比色法均显示，KFb的生长增殖明显较NsFb与HTsFb快，表现为进入对数生长期的时间短而持续时间长且没有明显的平台期;HTsFb的增殖较NsFb略慢，但基本趋势一致，无明显区别（Fig4）.
2.3 细胞的DNA代谢及胶原合成 结果表明，KFb的DNA合成量及胶原合成量均明显高于NsFb与HTsFb（P&<0.05），后两者在DNA合成方面无明显区别，在胶原合成方面HTsFb略高于NsFb（Fig5，6）. 图4 － 图6 略
3 讨论
烧伤及皮肤损伤是临床上较常见的病种，其损伤后的愈合过程是一系列修复细胞如表皮细胞、成纤维细胞及内皮细胞等与细胞外基质及多种细胞生长因子共同作用的结果，其中成纤维细胞的生物学活动构成了创面愈合与瘢痕形成的主要病理学基础，因此目 前国内外在研究增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的形成机制时主要将目光集中于成纤维细胞生物学行为及其相关因素的研究方面［4-6］ .
从皮肤组织中获取成纤维细胞的方法有消化法和组织块法两种，消化法又分为胰酶消化法及胶原酶消化法，由于消化法易受组织块的来源、大小、酶作用的时间和温度等多方面因素的影响［7］ ，因此在本实验中对三种组织我们均采用组织块法进行细胞的原代培养.人体成纤维细胞在体外培养情况下一般能存活一年左右，能继续培养50代，用于实验时国外学者多采用3～10代［8，9］ 处于对数生长期的细胞.
我们首先通过组织块培养法对正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中的成纤维细胞进行了原代培养研究，发现它们在细胞游出及生长方面均存在着一定的差异，其中瘢痕疙瘩成纤维细胞表现最为活跃.其次在细胞的继代培养研究中，我们通过比较它们在生长增殖、DNA代谢及胶原合成等方面的区别，进一步证实瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学功能远较其他两种成纤维细胞活跃，这与临床上这三者的区别是一致的.来自增生性瘢痕的成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞之间虽有一定区别但差异不明显，这可能是临床上增生性瘢痕在晚期发生退化的原因之一.
综上所述，我们的研究在一定程度上揭示了不同组织来源的成纤维细胞在生物学特性上的差异，同时说明在进行相应研究时应有一定的针对性.
参考文献
［1］Chen B，Jia CY，Su YJ，Xu MD，Hu DH，Zhu XX.Better life quality:Large sheet thin and/or split-thickness skin autograft-ing in the treatment of extensive third degree burn victims ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:420-422.
［2］Murray JC，Pollack SV，Pinnell SR.Keloids:A review ［J］.J Am Acad Dermatol，1981;4（3）:461-468.
［3］Robert F，Diegelmann.Cell culture and biochemical aspects of normal and abnormal wound healing:An overview ［J］.J Urol，1997;157（2）:298-302.
［4］Colige AC，Lambert CA，Nusgens BV.Effect of cell-cell and cell-matrix interactions on the response of fibroblasts to EGF in vitro ［J］.Biochem J，1992;285（3）:215-221.
［5］Han JT，Liu SJ，Chen B.Effects of suramin on proliferation of keloid fibroblasts in vitro ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:451-452.
［6］Zhang LX，Guo SZ，Wang Z.Biological effects of supernatant from melanocytes culture on proliferation of hypertrophic scar fi-broblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），1999;20（2）:166-167.
［7］Dong ML，Chen B，Xu MD，Su YJ，Tang CW.PDGF-AB ef-fects on proliferation of hypertrophic scar fibroblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:437-438.
［8］SiTu ZQ，Wu JZ.Xibao Peiyang（Cell culture）［M］.Xi’an:Shijie Tushu Chubanshe（World Books Publishing Company），1996:9-11.
［9］Er Z.Zuzhi Peiyang Jishu（Tissueculturetechniques）［M］.Bei-jing:Beijing People’s Publishing Company，1992:136-137.