作者：张传山 王文亮 彭玮丹 胡沛臻 柴玉波 张衍国
【关键词】 肝肿瘤
关键词: 肝肿瘤;bcl-2;核酶;脱噬作用
摘 要:目的 观察bcl-2核酶对SMMC-7721细胞的作用，探讨bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响. 方法 经脂质体介导的方法将PMTr-neo（正向bcl-2核酶真核表达载体）导入SMMC7721细胞中，细胞克隆转移扩大培养后，采用TUNEL，TRAP-PCR-ELISA，免疫组化技术结合图像分析技术检测SMMC7721/PMTr-neo细胞凋亡、细胞端粒酶活性及P16，P21的改变. 结果 较对照组SMMC7721/PMTr-neo细胞Bcl-2表达水平显著下降，伴有显著细胞凋亡现象;同时端粒酶活性下降，P16，P21表达水平显著增加. 结论 bcl-2核酶可促进SMMC7721细胞发生凋亡，并降低细胞端粒酶活性，提示Bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性有一定的影响.
Keywords:liver neoplasms;bcl-2;ribozyme;apoptosis
Abstract:AIM To observe the effect of bcl-2ribozyme on SMMC7721cells and to investigate bcl-2expression on cellu-lar apoptosis and telomerase activity.METHODS PMTr-neo（sense bcl-2ribozyme eucaryotic expression vector）was introduced into SMMC7221cells by using lipofectin media-tion，after cloning TUNEL and TRAP in combination of ELISA and IHC in combination of imaging analysis was used to determine SMMC7721/PMTr-neo apoptosis and telom-erase activity.RESULTS Compared with control，SMMC7721/PMTr-neo presented a significant drop in bcl-2expression and an increase in P16and P21expression，accom-panied by a decline in remarkable apoptosis and telomerase activity.CONCLUSION bcl-2ribozyme promotes apoptosis of SMMC7721cells and reduces telomerase activity.These provide a theoretical basis for applying antisense technique to treatment of hepatocarcinoma.
0 引言
抗凋亡蛋白Bcl-2在肿瘤发生过程中有着重要意义.自从Vaux首次证实bcl-2高表达可以诱发肿瘤后，人们对其进行深入研究，发现bcl-2可以抑制细胞凋亡、延长细胞生存期［1-3］ 人们对bcl-2与肝癌的关系也进行了探讨，认为它与肝癌的发生也存在密切关系.目前有关核酶的研究在生物学领域中已成为新的热点:一方面可以利用核酶来研究特定基因的功能，因而其在基因表达调控研究中倍受重视;另一方面将核酶应用于基因治疗较其他反义技术具有更多优点.在肿瘤治疗方面，人们也开始有益的尝试，希望核酶能为肿瘤治疗提供新的有效手段.我们采用脂质体介导的基因转移方法，将bcl-2核酶导入人肝癌细胞株SMMC7721细胞中，结合TUNEL，TRAP-PCR-ELISA及免疫组化等技术观察bcl-2核酶对SMMC7721细胞的影响，为肿瘤基因治疗提供理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌JM109由本校生物化学教研室惠赠;PMTr-neo质粒（含bcl-2核酶）由彭玮丹博士构建［4］ ;核酸内切酶购自Promega公司;脂质体转染试剂盒购自Gibico公司;凋亡检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司;SMMC7721细胞由本室保存培养.
1.2 方法
1.2.1 PMTr-neo转染SMMC7721细胞 ①PMTr-neo质粒的鉴定:将PMTr-neo质粒转化JM109大肠杆菌，扩增提取质粒，经核酸内切酶BamHI，EcoRI双酶切后，电泳鉴定bcl-2核酶片段大小正确.②PMTr-neo转染SMMC7721细胞:把处于对数生长期的SMMC7721细胞分为两组:对照组（SMMC7721细胞）、实验组（转染PMTr-neo的SMMC7721细胞），转染方法按脂质体转染试剂盒操作步骤说明进行，培养48h后传代，加入含G418550mg L-1 的培养液，筛选抗性细胞.继续培养2wk后，可见细胞克隆形成，继续扩大培养.③SMMC7721/PMTr-neo细胞的鉴定:细胞克隆扩大培养后，制作细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，免疫组化检测.Bcl-2单抗购自博士德生物公司，免疫组化按照DAKO公司Envi-sionTM +System，HRP试剂盒说明进行.免疫组化检测步骤如下:①30mL L-1 h3 O2 甲醇封闭30min;②3mL L-1 BSA封闭30min;③加一抗4℃过夜;④加DAKO EnvisionTM +System，HRP，mouse，（R4001）;⑤显色，苏木精衬染封片.以上步骤均用PBS缓冲液洗涤，光镜下观察结果.同时设立对照实验.
1.2.2 bcl-2核酶对SMMC7721细胞作用 ①TUNEL检测:细胞克隆扩大培养后，细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，检测细胞凋亡情况.实验操作步骤参照In Situ Cell Death Detection Kit，AP操作说明进行.②TRAP-PCR-ELISA端粒酶活性检测:分别收集用100μmol L-1 硫酸锌诱导表达48h的1×107 对照组细胞、实验组细胞，进行细胞端粒酶活性检测.细胞端粒酶活性检测按照TRA-PCR-ELISA.AP试剂盒操作说明书进行.在DYNATECH MR400仪器上检测波长为450nm/630nm处各组细胞的吸光度（A）.参照试剂盒结果判别说明，证实检测结果有效.③P16，P21免疫组化检测:细胞克隆扩大培养后，细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，免疫组化检测.P16，P21单抗购自中山生物公司，免疫组化检测步骤同上述.在高倍视野（×400）下，选择5个视野，分别计数200个细胞，并应用HPIAS-1000图文报告管理系统进行处理，检测细胞平均吸光度（A）.
统计学处理:将所得各种实验数据结果，分别进行统计学处理.其中有关率的变化采用χ2 检验，有关x ±s，采用t检验.
2 结果
2.1 TUNEL检测 光镜观察可见SMMC7721/PMTr-neo较对照组细胞凋亡数量显著增多（Fig1，2），在高倍视野（×400）下，选择5个视野分别计数200个细胞，统计凋亡细胞所占百分比，发现实验组凋亡细胞（24±4）/200（12.0±2.0）%，比对照组（8±4）/200（4.0±2.0）%明显增多（P&<0.01，χ2 =7.643）.
图1 － 图2 略
2.2 TRAP┐PCR┐ELISA端粒酶活性检测 结果显示，SMMC7721细胞表达高水平的端粒酶活性，吸光度（A450 -A630 ）为2.861，而转染bcl-2核酶的细胞SMMC7721/PMTr-neo端粒酶活性表达显著下降，吸光度（A450 -A630 ）仅为0.980.说明转染bcl-2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性有一定影响.
2.3 Bcl┐2，P16，P21组化检测 在SMMC7721/PMTr-neo细胞中，未能检测到Bcl-2蛋白，而对照组Bcl-2结果为阳性，说明在Zn2+ 诱导下bcl-2核酶有效表达，在转录水平上封闭了bcl-2表达.光镜观察可见SMMC7721/PMTr-neo较对照组细胞P16，P21蛋白表达水平显著增高，组化结果呈强阳性.应用图像分析仪测定免疫组化染色p16，p21阳性细胞吸光度（A），实验组为:0.18±0.02，0.19±0.03，对照组为:0.23±0.06，0.26±0.02.实验组较对照组显著增高（P&<0.05）.
3 讨论
凋亡是细胞死亡的一种生理机制，在调节组织内环境稳定过程中起重要作用.凋亡的调节是一种非常复杂的过程，涉及到许多癌基因与抑癌基因的表达.Bcl-2是肿瘤研究中最受关注的抑制凋亡蛋白，认为其在肿瘤发生中有重要意义［1-3］ .目前有关核酶的研究在生物学领域中已成为新的热点［5，6］ ，将核酶应用于基因治疗较其他反义技术具有更多优点:核酶具有较为稳定的空间结构，不易受RNase的攻击;单个核酶分子可与多个RNA分子结合并使其在特定部位断裂，而核酶本身并不消耗，可重复利用.正是基于核酶的众多优点，在肿瘤治疗方面，人们也开始有益的尝试，希望为肿瘤治疗提供了新的手段.
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