关键词: 肺肿瘤;p185neu ;p21ras ;免疫组织化学
摘 要:目的 检测c-erbB-2基因产物p185neu 和ras基因产物p21ras 在肺癌组织的表达情况，以揭示c-erbB-2和ras基因在肺癌形成中的作用及其相互关系. 方法 运用免疫组织化学SABC法检测55例原发性肺癌组织中2种基因产物. 结果 10例小细胞肺癌组织均无p185neu 和p21ras 的阳性表达.28例肺鳞癌中p185neu 和p21
ras 阳性表达率分别是46%（13/28）和54%（15/28）.16例肺腺癌中p185neu 阳性表达率为56%（9/16），p21
ras 阳性表达率为62%（10/16）.肺鳞癌和肺腺癌中2种蛋白的阳性表达率均无显著性差异（P&>0.05）.p185neu 阳性表达与淋巴结转移具有明显相关性（r=0.36，P&<0.05），与其他临床病理因素无关;p21ras 阳性表达与淋巴结转移、肿瘤大小等临床病理因素无关.p185neu 和p21ras 在肺癌组织中的表达水平呈正相关（r=0.52，P&<0.01）. 结论 c-erbB-2和ras基因的改变与非小细胞肺癌（NSCLC）的发生有关，这2种基因在NSCLC的形成和发展中具有协同作用.同时，检测p185neu 和p21ras 还有助于评估肺癌患者的预后.
Keywords:lung neoplasms;p185neu ;p21ras ;immunohis-tochemistry
Abstract:AIM To shed light on the relationship among c-erbB-2gene，ras gene，and the carcinogenesis of lung cancer by measuring p185neu and p21ras （the products of the c-erbB-2gene and ras gene respectively）in lung cancer tissues.METHODS Two genes’products were detected in primary lung cancer tissues by SABC，an immunohistochemical method，for55cases.RESULTS Of10cases of small cell lung cancer（SCLC），none was p185neu or p21ras positive.And of28cases of squamous carcinoma，the rates of p185neu and p21ras positive expression were46%（13/28）and54%（15/28）respectively.Of16cases of adenocarcinoma，the rates of the two genes’positive expression were56%（9/16）and62%（10/16）respectively.There was no significant differ-ence between the positive expression rates of the two genes in the squamous and adenocarcinoma（P&>0.05）.The p185neu positive expression was significantly correlated（r=0.36，P&<0.05）to lymph node metastasis but not significantly corre-lated to other clinical pathological factors.However，p21ras positive expression had no significant correlation with such clinical pathological factors as lymph node metastasis and the size of tumor.The expression of p185neu and p21ras was posi-tively correlated（r=0.52，P&<0.01）in lung cancer tissues.CONCLUSION Change in c-erbB-2gene and ras gene is re-lated to the carcinogenesis of non-small cell lung cancer and plays a cooperative role in the carcinogenesis and development of NSCLC.Detecting p185neu and p21ras is useful for the eval-uation of the prognosis of lung cancer patients.
0 引言
癌基因的激活在肿瘤的发病机制中起重要的作用.大量研究结果表明，肺癌的发生是一个涉及多基因、多阶段的事件，至少需要两个或两个以上活化的癌基因协同作用才能使正常细胞发生恶性转化［1，2］ .许多研究显示，c-erbB-2原癌基因扩增和过度表达与乳腺癌，卵巢癌和胃癌等多种癌症密切相关［3-5］ ，该基因的激活使患者的存活期明显缩短.ras基因的活化与肺癌，尤其与非小细胞肺癌（NSCLC）关系密切.目前有关肺癌形成中这两种基因相互关系的报道较少.我们通过应用免疫组织化学方法检测c-erbB-2基因产物p185neu 和ras基因产物p21ras 在肺癌组织中的表达情况，探讨c-erbB-2和ras基因在肺癌形成中的作用及二者的相互关系.
1 材料和方法
1.1 材料 选用西京医院1997/1999年间临床资料齐备的肺癌患者的纤维支气管镜活检标本55（鳞癌28，腺癌16，小细胞癌10，大细胞癌1）例.男性47例，女性8例，年龄18～72（平均54.42）岁.40g・L-1 甲醛固定标本，石蜡包埋，肺癌组织学类型按WHO标准分类［6］ .
1.2 试剂及染色方法 采用武汉博士德生物公司提供的即用型试剂盒.采用SABC染色方法，操作步骤按照试剂盒说明书进行.切片脱蜡至水后，用30mL・L-1 h3 O2 处理10min，正常山羊血清封闭.分别滴加一抗，4℃过夜，PBS洗涤，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min，滴加试剂SABC，20min后用DAB液显色，苏木精复染，封片，显微镜下观察.用PBS代替第一抗体作阴性对照，用已知乳腺癌阳性切片作阳性对照.
1.3 结果判定方法 p185neu 阳性以细胞膜及细胞质中有棕黄色颗粒为阳性细胞.p21ras 蛋白主要以细胞膜内侧和细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性.阳性表达标准参照Barnes提出的半定量分析方法，阳性细胞数量计0～4分，无计0分;小于或等于25%计1分;26%～50%计2分;51%～75%计3分;大于75%计4分.染色强度计1～3分，浅黄色计1分;棕黄色计2分;棕褐色计3分;将两项指标评分相乘，根据总分分为四级即阴性（-）为0分，弱阳性（+）为1～2分，阳性（）为3～4分，大于4分则为强阳性（）.
统计学处理:采用χ2 检验和非参数相关性分析.
2 结果
2.1 肺癌组织中p185neu 和p21ras 的表达 p185neu 阳性产物主要位于细胞膜和细胞质中（Fig1）.55例肺癌中22例呈阳性反应，占40%，无1例小细胞肺癌呈阳性反应.腺癌的阳性率为56%，鳞癌的阳性率为46%，两者相比无显著性意义（P&>0.05）.p21ras 阳性产物主要位于细胞膜内侧和细胞质中（Fig2），55例肺癌中有25例呈阳性反应，占45%，无1例小细胞肺癌呈阳性反应.腺癌的阳性率为62%，鳞癌的阳性率为54%，两者的差异无显著性意义（P&>0.05）.
2.2 p185neu ，p21ras 与临床病理因素之间的关系 p185neu 蛋白过量表达与淋巴结转移明显相关（r=0.36，P&<0.05）.p185neu 过量表达与其他临床病理因素无明显相关性（P&>0.05）.p21ras 过量表达与临床病理因素无明显相关性（P&>0.05，Tab1）.
2.3 肺癌组织中两种蛋白表达的相互关系 在55 例肺癌组织中p185neu 和p21ras 均为阳性表达者占17例.经2×2交叉分类资料检验及非参数相关性分析结果显示，p185neu 和p21ras 在肺癌组织中的表达水平呈正相关（r=0.52，P&<0.01）.
图1 － 图2 略
表1 肺癌不同病理因素中p185neu 和p21ras 的表达 略
3 讨论
c-erbB-2基因是1981年由Shih等［7］ 在研究化学物质诱导大鼠神经母细胞瘤的DNA中发现的一种原癌基因.该基因定位于人染色体17q21［8］ ，编码相对分子质量为185×103 的跨膜糖蛋白p185neu .近些年来，c-erbB-2基因与肿瘤之间的相关性已引起人们极大的兴趣，但大量研究重点集中在c-erbB-2基因与乳腺癌、卵巢癌及胃癌之间关系方面，而有关肺癌中c-erbB-2基因扩增和蛋白过度表达情况的报道较少.已有初步实验结果显示c-erbB-2基因与NSCLC有一定的相关性，如Osaki等［9］ 研究发现40例肺腺癌组织切片中，p185neu 阳性表达17例，阳性表达率达42%.但是目前仍缺乏肺鳞癌中p185neu 阳性表达情况的研究.而本研究结果显示，NSCLC中存在p185neu 过度表达，鳞癌和腺癌的阳性表达率分别为46%和56%，两者无显著性差异.同时，p185neu 阳性表达与淋巴结转移具有明显相关性，与其他临床病理因素无关，由此说明p185neu 过度表达促进了受体二聚化和寡聚化，增强酪氨酸激酶活性，激活异常细胞信号，进而形成肿瘤细胞恶化表型，c-erbB-2基因高水平表达与肺癌的恶性生物学行为密切相关，检测p185neu 有助于评估肺癌患者的预后. 转贴于 ras原癌基因对细胞的增殖及分化具有重要作用.其产物p21ras 是一种G蛋白，与GTP和GDP有高度的亲和性，具有GTP酶的活性，它从细胞表面受体传递增殖信号至细胞核中发挥作用.p21ras 过度表达或ras基因突变会使信号传导发生障碍，引起肿瘤形成.Harada等［10］ 用p21ras 单抗研究116例NSCLC标本，其中鳞癌阳性者为56%，腺癌为72%，p21ras 阳性与生存期呈负相关.而我们的结果显示，55例肺癌组织中，鳞癌与腺癌的阳性表达率分别为54%和62%，两个阳性表达率相比无显著性差异.p21ras 阳性表达与淋巴结转移、肿瘤大小等临床病理因素无明显相关性，由此揭示p21ras 过度表达可能是一个独立于组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移之外的不良预后因素.
我们的结果显示p185neu 与p21ras 表达水平在肺癌组织中呈正相关，这表明c-erbB-2和ras基因在肺癌形成过程中具有协同作用，可能的解释是这两种基因均位于细胞信号传导通路中，当细胞表面c-erbB-2表达产物大量聚集后，通过级联反应可导致ras癌基因的活化，同时，p21ras 的结合也可能导致c-erbB-2基因扩增或表达产物的磷酸化，这两种癌基因之间相互作用机制目前尚不完全清楚，仍需进一步探讨.
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