【关键词】 ,血管钠肽
关键词: 血管钠肽;低氧;心成纤维细胞;c-fos;Ca2+
摘 要:目的 研究血管钠肽(VNP)对低氧作用时心成纤维细胞增殖的影响,并对其机制进行探讨. 方法 分离纯化乳鼠心成纤维细胞,随机分为4组:对照组、低氧组(20~30mL・L-1 )、VNP组(10-8 ~10-6 mol・L
-1 )和VNP(10-6 mol・L-1 )+低氧组.以免疫组织化学染色方法观察各组c-Fos的表达情况,采用激光共聚焦方法测定了[Ca2+ ]i 水平. 结果 ①低氧组较对照组可以显著升高Fos样免疫阳性细胞数及染色强度(P&<0.05);②VNP预处理心成纤维细胞可以减弱低氧的作用(P&<0.05vs低氧组),但Fos的表达量仍高于对照组(P&<0.05);③对照组[Ca2+ ]i 水平无显著变化,低氧组[Ca2+ ]i 水平显著升高,而VNP能使升高的[Ca
2+ ]i 水平较对照组和低氧组显著降低(P&<0.05). 结论 VNP能减弱低氧对心成纤维细胞生长的刺激作用,其机制可能与Ca2+ 等信号转导分子及c-fos表达有关.
Keywords:vasonatrin peptide;hypoxia;cardiac fibroblasts;c-fos;Ca2+
Abstract:Chief aim of the present work was to investigate vasonatrin peptide(VNP)attenuates hypoxia-induced expression of c-fos gene in cardiac fibroblasts from cultured neonatal rats.The cultured cardiac fibroblasts were pided randomly into four groups:Control group,hyoxia group(20~30mL・L-1 ),VNP group(10-8 ~10-6 mol・L-1 )and VNP(10-6 mol・L-1 )+hypoxia group.The c-Fos expres-sion of cardiac fibroblasts was measured by the means of im-munocytochemistry,[Ca
2+ ]i concentration was measured by the means of interactive laser cytometer.The studies per-formed with these techniques show that hypoxia increased significantly the positive cells and mean grey of cardiac fi-broblasts(P&<0.05vs control group),VNP decreased the positive cells(P&<0.05vs control group)and decreased the level of [Ca2+ ]i in VNP+hypoxia group.These findings indi-cate that VNP can attenuate hypoxia-induced expression of c-fos gene in cardiac fibroblasts which was associated with the changes of the[Ca2+ ]i .
0 引言
低氧性心室肌肥厚是高原性心脏病的主要表现之一,而心室肌肥厚的原因除了心肌细胞的肥大外,心肌间质细胞的增殖、间质纤维化也是重要的原因,而且心成纤维细胞分泌许多生长因子,通过旁分泌途径影响心肌细胞的增殖.因此,了解影响心成纤维细胞增殖和基因表达的因子非常必要.钠尿肽是一多肽家族,具有利钠利尿以及抑制心肌肥厚的作用.ANP(心房钠尿肽)可抑制低氧引起的心成纤维细胞的增殖[1] ,VNP(血管钠肽)是ANP和C-型钠尿肽(CNP)的嵌合体,可能与ANP有相似的药理效应[2,3] .低氧可引起心成纤维细胞增殖,细胞内钙增多,以及c-Fos表达增高[4] .关于VNP对c-fos表达的调控,目前国内外尚无报道.我们观察VNP是否减弱低氧刺激的心成纤维细胞增殖,及其是否影响c-fos表达以及机制.
1 材料和方法
1.1 材料 SD乳鼠(1~2d)由本校实验动物中心提供,胰酶购于DIFCO公司,胶原酶、EDTA,DMEM培养基、小牛血清购于Gibco公司,VNP由中国科学院上海生物化学研究所提供,BrdU(5’-溴-2-脱氧尿苷)购于Sigma公司,c-Fos抗体购于Santa Cruz公司,ABC试剂盒购于博士德公司,LE-ICAO500MC图像分析仪购于德国Leica公司.
1.2 方法
1.2.1 主要药物配制 VNP:用生理盐水配成10-3 mol・L-1 的原液,4℃保存,实验前用DMEM培养基稀释成工作液.DMEM培养基:按说明书配置,用0.1mol・L-1 的盐酸调pH至7.2~7.4,4℃保存备用.小牛血清:56℃灭活30min,-20℃保存.胰蛋白酶:用生理盐水配成2.5g・L-1 的溶液,4℃保存备用.EDTA:用生理盐水配成0.4g・L
-1 的溶液,4℃保存备用.胶原酶:用生理盐水配成1.5g・L-1 的溶液,4℃保存备用.
1.2.2 心成纤维细胞培养 无菌条件下取出乳鼠的心脏,剪碎,以1.25g・L-1 胰蛋白酶及0.75g・L-1 的胶原酶消化成单细胞悬液,离心(1000r・min-1 ,5min),用含0.1mmol・L-1 BrdU及100mL・L-1 灭活小牛血清的DMEM培养基重新悬浮,贴壁90min后将悬浮细胞吸弃,加入含100mL・L-1 灭活小牛血清的DMEM培养基传代至2~4代时,将心成纤维细胞以5×107 L-1 接种于24孔培养板(预置10mm×10mm的盖玻片,用于免疫组化染色)或100mL的玻璃培养瓶(用于传代),或以1×107 L-1 ,每皿0.3mL接种于培养皿之后,移入37℃,50mL・L
-1 CO2 培养箱中培养.若细胞贴壁并已伸展但未汇合(sub-confluent),用台盼蓝拒染法检查活细胞数大于
95%,继续以后实验.
1.2.3 细胞低氧培养方法 将接种于培养瓶或培养板的细胞放置于一体积约7L的真空干燥瓶中,通入950mL・L-1 N2 和50mL・L-1 CO2 的混合气体,以2L・min-1 ,通气12min,使真空干燥瓶中气体浓度达到20~30mL・L-1 O2 和50mL・L-1 CO2 ,并可持续24h.
1.2.4 免疫组织化学染色 药物及20~30mL・L-1 O2 低氧作用2h后,以40g・L-1 的多聚甲醛固定(4℃,20min),然后以15g・L-1 的正常羊血清孵育30min以封闭组织中的抗体非特异性结合位点.将2g・L-1 BSA/0.5g・L-1 NaN3 /PBS稀释的FOS抗体(1∶1000)加至玻片上,4℃孵育48h,再依次在生物素化抗IgG(1∶400)和ABC液(1∶200)中分别孵育2.5h(25℃).最后用硫酸镍铵葡萄糖氧化酶法呈色,脱水透明后封片.实验中同时设立空白和替代对照实验.
1.2.5 MTT比色法 将心成纤维细胞以5×107L-1 每孔100μL种至96孔板,24h后换为各种浓度 的药物,每组为8个复孔.置于低氧或常氧24h,以5g・L-1 ,每孔20μL,加入MTT.4h后吸弃液体,以每孔150μL加入DMSO,轻轻震荡10min,用酶联免疫分析仪测A490nm 值.
1.2.6 [Ca2+ ]i 的测定 将心成纤维细胞以1×107 L-1 每皿0.3mL种至中心有孔的培养皿上.待细胞贴壁后,用台氏液洗涤细胞2次,于37℃,闭光条件下用furo-3/AM(10μmol・L-1 )荷载,50min后用台氏液洗涤3次,洗去残余染料.用共聚焦显微镜动态扫描细胞内[Ca2+ ] i 荧光强度变化.
1.2.7 数据处理及统计学分析 免疫组化结果用LEICAO500MC图像分析系统对细胞数及染色强度进行定量分析.采用双盲法,输入方式为普通光源照明,显微镜放大倍数400倍,固定输入条件后,在高分辨率图像监视器上每张玻片随机抽取5个视野,测定每个视野的阳性细胞百分数及阳性物质的平均灰度(mean grey),测量单位为AU(arbitray unit).计算其均值,再求出每组的平均值.数据以x ±s表示,两组间比较采用t检验;多组间比较采用方差分析及两两显著性检验.
2 结果
2.1 VNP对低氧刺激的心成纤维细胞增殖的影响 培养板放入低氧环境后,心肌细胞的A490nm 值增加.VNP可以降低低氧刺激的心成纤维细胞A490nm 值,VNP降低此作用,且呈剂量依赖性(Tab1). 转贴于 表1 血管钠肽对低氧刺激心成纤维细胞MTT光吸收值的影响 略
2.2 VNP对低氧诱导的FOS样免疫反应阳性细胞数目的影响 对照组(常氧和不加VNP)有少量细胞呈弱阳性表达(Fig1A)低氧组的FOS样免疫反应阳性心成纤维细胞占(84.6±7.8)%,染色强度为(204±12)AU(P&<0.05vs对照组),阳性产物主要存在于细胞核中,呈椭圆形或圆形,紫黑色,可见不着色的核仁区(Fig1B).单独用VNP(10-6 mol・L-1 )处理,对心肌细胞FOS蛋白表达无显著影响.以VNP(10-6 mol・L-1 )预处理30min,可减弱低氧增强FOS蛋白表达的作用,FOS样免疫反应阳性心成纤维细胞占(76.1±7.1)%,染色强度为(184±10)AU(P&<0.05vs低氧组),但FOS蛋白的表达仍高于对照组的基础水平(P&<0.05,Fig1C).
图1 乳鼠心成纤维细胞的Fos染色 略
2.3 VNP对心肌细胞内Ca2+ 水平的影响 低氧使心成纤维[Ca2+ ]i 相对水平显著升高,VNP可使低氧时显著升高的[Ca2+ ]i 相对水平降低.对照组[Ca2+ ]i 相对水平为(2.30±0.21)U,低氧组Ca2+ 相对水平为(4.45±0.36)U,VNP组[Ca2+ ]i 水平为(2.96±0.11)U,显著低于低氧组(P&<0.05,Fig2).
图2 略
3 讨论
c-fos属于即刻早期反应基因(IERG),即刻早期反应基因是细胞在受刺激后短时间内发生反应的基因家族.此类基因表达的蛋白可与DNA结合,影响细胞的分化、增殖和凋亡等功能.另外,即刻早期反应基因也说明细胞对环境刺激的适应性反应[1] .
低氧时呼吸链中的酶降低及细胞内氧化还原反应发生改变.低氧条件下是通过血清反应序列(SRE)引起c-fos的转录活性的激活.而丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)在低氧条件下激活.因此,低氧时细胞内呼吸链中酶水平的降低是通过MAPK途径引起c-fos表达增加[5] .c-fos的产物Fos单独不能与DNA结合,它可与Jun通过亮氨酸拉链形成Fos/Jun二聚体,即有活性的AP-1.AP-1通过顺式作用,激活与细胞生长有关的基因,由于Fos将细胞外传来的信号与细胞核内的基因活动联系起来,因而称为第三信使[6] .正常情况下,c-fos基因在造血组织以外的大多数其他类型的细胞仅有低水平表达,但儿茶酚胺、生长因子、应急等多种因素可使这些组织表达增加[7] .它的激活不依赖于新蛋白的合成,而是由于已存在蛋白质的修饰,这种修饰主要通过第二信使介导.c-fos基因上游的顺式作用元件构成其转录的调控单位.其中最重要的是SRE和血小板源生长因子(c-sis)诱导序列,SRE的调控中心由血清反应因子(SRF)占据,SRF是一个二聚体蛋白,在它旁边还有多种蛋白与SRE的其他区域结合,其中较为重要的是胞核原癌蛋白ETS中的EIK-1,EIK-1的作用依赖于SRE与SRF的结合.SRF和EIK-1均是MAPK的靶分子,存在于细胞内的Raf-MAPK激酶-MAPK-核糖体S6 激酶网络通过MAPK从胞质到胞核的易位与核内c-fos发生联系,MAPK在核内累积达到峰值,此时正是c-fos转录的峰值[8] .
增加细胞内Ca2+ 可能是参与低氧引起c-fos表达的一种第二信使[9] .ANP可增加低氧时培养的细胞内cGMP含量,降低Ca2+ 内流并具有浓度及时间依赖性.ANP调控Ca2+ 通道直接通过百日咳毒素敏感性G蛋白,经过cGMP和通过百日咳毒素不敏感性G蛋白的不依赖cGMP的Ca2+ 通道,来减弱低氧对细胞的刺激作用[10] .VNP是ANP和C-型钠尿肽(CNP)的嵌合体,可能与ANP有相似的药理效应[2,3] .应用VNP能够减弱低氧诱导的c-fos表达,在两栖类动物的细胞中,L型Ca2+ 通道的抑制与激活磷酸二酯酶导致的cAMP水平降低有关.在哺乳动物细胞中,cGMP抑制Ca2+ 流的效应不依赖于cAMP水平的变化,而是直接作用于L型Ca2+ 通道[11] .VNP可能通过升高心成纤维细胞内cGMP水平直接抑制Ca2+ 通道,拮抗低氧对Ca2+ 通道的激活作用,使心成纤维细胞内Ca
2+ 浓度降低,使c-fos基因转录活性下降.即VNP减弱低氧刺激心成纤维细胞c-fos表达的机制在于二者对心成纤维细胞Ca2+ 通道的效应是互相拮抗的,并且VNP的这种效应是通过cGMP水平的变化实现的.
参考文献
[1]Tamamori M,Ito H,Hiroe M,Marumo F,Hata RI.Stimula-tion of collagen synthesis in rat cardiac fibroblasts by exposure to hypoxic culture conditions and suppression of the effect by na-triuretic peptides [J].Cell Biol Int,1997;21(3):175-180.
[2]Feng HS,Zang YM,Zhu MZ,Pei JM,Wang YM,Niu GM,Wang L,Shi PT.Vasorelaxing effect of vasonatrin peptide on pumonary artery in rats [J].Xin Gongneng Zazhi(Chin J Card Fun),1998;10(2):69-71.
[3]Wei CM,Kim CH,Miller VM,Burnett JC Jr.A unique syn-thetic natriuretic and vasorelaxing peptide [J].J Clin Invest,1993;92(4):2048-2052.
[4]Nauduri RP,Bhami CS,Michael SS.Cell selective induction and transcriptional activation of immediate early genes by hypox-ia [J].Brain Res,1995;697:266-270.
[5]Muller JM,Krauss B,Kaltschmidt C,Baeuerle PA,Rupec RA.Hypoxia induces c-fos transcription via a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway [J].J Biol Chem,1997;272(37):23435-23439.
[6]Premkumar DR,Adhikary G,Overholt JL,Simonson MS,Cherniack NS,Prabhakar NR.Intracellular pathways linking hypoxia to activation of c-fos and AP-1[J].Adv Exp Med Bi-ol,2000;475:101-109.
[7]Gonzalez FA,Seth A,Raden DL,Bowman DS,Fay FS,Davis RJ.Serum induced translocation of mitogen-activated protein ki-nase to the cell surface ruffling membrane and the nucleus [J].J Cell Biol,1993;122(5):1089-1101.
[8]Liu QY,Karpinski E,Pang PK.The L-type calcium channel current is increased by alpha-1adrenoceptor activation in neona-tal rat ventricular cells [J].J Pharmacol Exp Ther,1994;271(2):935-943.
[9]Premkumar DR,Mishra RR,Overholt JL,Simonson MS,Cherniack NS,Prabhakar NR.L-type Ca
2+ channel activation regulates induction of c-fos transcription by hypoxia [J].J Appl Physiol,2000;88(5):1898-1906.
[10]The protective effect of natriuretic peptide(ANP)on cells dam-aged by oxygen radicals is mediated through elevated cGMP-lev-els,reduction of calcium-inflow and probably G-proteins [J].Biochem Biophys Res Commun,1991;174(2):549-555.
[11]Tohse N,Nakaya H,Takeda Y,Kanno M.Cyclic GMP medi-ated inhibition of L-type Ca2+ channel by the human natriuretic peptide in rabbit heart cells [J].Br J Pharmaco,1995;114(5):1076-1082.