关于BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定

【关键词】 BMPsⅡ型突变受体
　　关键词: BMPsⅡ型突变受体;真核表达载体
　　0 引言
　　骨形成蛋白（BMPs）不仅在骨，软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用，而且起着十分重要的调控作用［1］ .与其他TGF-β超家族成员一样，BMPs在细胞表面与BMP的Ⅰ，Ⅱ型受体相互作用，Ⅰ型受体可以和过量的配体结合，而Ⅱ型受体与配体的结合则是特异性的［2］ .tBRK3k为BMPsⅡ型突变受体，其可以阻断BMP的信号转导，这样，BMP就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育，器官形成及细胞分化中的作用.因此，为研究BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用，我们构建了BMPsⅠ型突变受体的真核表达载体，为此方面研究的开展奠定了基础.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 pSP64TL-tBRK3k质粒为含有BMPsⅡ型突变受体cDNA的克隆质粒，由日本的Nohno教授（Kawasaki医学院分子生物所）提供.真核表达载体pCDNA3（neo）购自本校生物化学教研室.限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自华美公司.DNA回收纯化试剂盒购自原平公司.
　　
　　1.2 酶切鉴定及回收［3］ 将pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3（neo）用HindⅢ和XbaⅠ双酶切，经0.8%琼脂糖凝胶电泳分别得到0.6，2.9和5.4kb的片段，用试剂盒回收纯化0.6kb和5.4kb的片段.
　　
　　1.3 连接、转化和克隆筛选［3］ 取上述tBRK3k片段5μL和pCDNA3（neo）片段各2μL，加入T4DNA连接酶、缓冲液和无菌水各1μL，16℃连接过夜.制备大肠杆菌DH5α的感受态并转化.挑取单个菌落，液体LB培养基37℃振摇过夜，小提质粒，酶切鉴定筛选出阳性克隆，命名为pC-4.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3的酶切鉴定 pSP64TL-tBRK3k质粒经双酶切后，得到2.9kb和0.6kb两个片段;pCDNA3（neo）经双酶切后，得到一个5.4kb的片段，符合二者的物理图谱（图1）.
　　
　　图1 略
　　
　　2.2 pC-4的酶切鉴定 pC-4经HindⅢ和XbaⅠ双酶切后，得到0.6kb和5.4kb两个片段，证明tBRK3k基因已成功连入到pCDNA（neo）中（图1）. 　　3 讨论
　　TGF-β超家族的成员都结合二种特异受体发挥作用，分别叫做Ⅰ型受体（约50～55KD）和Ⅱ型受体（约70～80KD）［4］ .和其他TGF-β超家族成员一样，BMPs在细胞表面与Ⅰ，Ⅱ型受体相互作用.Ⅰ型受体可以和过量的配体结合，而Ⅱ型受体与配体的结合则是特异性的.因此，为研究BMPs信号转导在机体发育中的作用，我们将突变型BMPsⅡ型受体（tBRK3k）定向克隆到pCDNA3（neo）表达载体中（图2）.
　　
　　图2 略
　　
　　pCDNA3（neo）可用于在哺乳动物细胞系表达外源基因，全长5.4kb.其表达系统构件包括:CMV启动子，SV40复制起始点，SV40polyA，SV405’端和3’端剪切序列等，多聚接头有11个可供利用的单一酶切位点.
　　pC-4真核细胞表达载体可用于研究BMPs信号对间充质细胞分化的调控，对于研究和阐明BMPs在机体发育中的作用有重要意义.
　　参考文献:
　　
　　［1］Wozney JM，Rosen V.Bone morphogenetic protein and morpho-genetic gene family in bone formation and repair ［J］.Clin Or-thop，1998;346:26-37.
　　［2］Estevez M，Attisano L，Wrana JL et al.The daf-4gene encods a bone morphogenetic protein receptor controlling c.elegans dauer larva development ［J］.Nature，1993;365:644-649.
　　［3］J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南［M］.第2版.北京:科学技术出版社，1992:34-56.
　　［4］Heldin CH，Miyazono K，Ten Dijke P.TGF-βsignalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins ［J］.Nature，1997;390（4）:465-471.