作者：马妍 金岩 孙庆妹 李媛 Tipoe GL
【关键词】 ，细胞周期蛋白类
关键词: 细胞周期蛋白类;周期蛋白依赖激酶;上皮癌
摘 要:目的 通过检测口腔粘膜的正常上皮、非特异性炎症上皮及鳞癌中cyclin D1与CDK4的表达，探讨其在上皮组织不同状态中的变化及意义. 方法 用临床病理标本，设立对照，选择cyclin D1和CDK4抗体免疫组化染色. 结果 cy-clin D1和CDK4在正常口腔上皮与口腔鳞癌上皮、非特异性炎症与口腔鳞癌上皮中的表达间有统计学差别（P&<0.05），正常组与炎症组间无差别，cyclin D1及CDK4在口腔鳞癌上皮中过表达（P&<0.05）. 结论 cyclin D1与CDK4过表达的机制可能由于基因扩增或其他因素使其蓄积，口腔鳞癌组分级间的差异性提示其可作为肿瘤分级的评价指标之一.
Keywords:cyclins;cyclin dependent kinases;epithlium ma-lignant
Abstract:AIM To evaluate the expression and significance of cyclinD1/CDK4in normal epithelia（N），inflammatory（IF）and squamous cell cacinoma（SCC）of cheek mucosa.METHODS Oringinal pathology specimens were collected cut and immunostained by cyclin D1monoclonal antibody andCDK4polyclonal antibody，using the avidin-biotin peroxidase complex technique（ABC）.RESULTS There was statistical significance between the N group and SCC group，but not be-tween the N group and IF group.Cyclin D1and CDK4were overexpressed in SCC.CONCLUSION Overexpression of cyclinD1and CDK4in SCC may be due to the gene amplifica-tion and/or other related factors.The variations of cyclin D1and CDK4in different subgroups of SCC may be a helpful indicator for tumor grading.
0 引言
细胞周期蛋白D（cyclin Ds）及蛋白依赖激酶（CDKs）在调节细胞增殖周期中的作用已有大量研究报道［1，2］ ，其作为细胞分裂周期的起始点G1-S期的正性调节因子，使细胞分裂加速，在肿瘤的发生机制中具有重要意义，因此，我们拟对cyclin D1和CDK4在口腔颊部粘膜正常组（N）、炎症组（IF）、鳞癌组（SCC）中的表达进行免疫组化的定量研究，分析cyclin D1及CDK4在N，IF，SCC3组及不同鳞癌分级中的变化及意义.
1 材料和方法
1.1 标本制备 选用本科收集的标本，包括10例正常粘膜上皮（N组）、10例慢性非特异性炎症（IF组）和颊部鳞癌22例（SCC组），SCC组包括转移及复发的10例，并依据细胞分化程度、角化程度及核分裂为指标，按WHO标准将SCC组标本分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级（Ⅰ级8例，Ⅱ级9例，Ⅲ级5例），所有标本均为100mL・L-1 福尔马林固定，石蜡包埋，切片.
1.2 免疫组化染色 切片厚度为5μm，经梯度乙醇脱蜡至水，1g・L-1 胰酶消化，30mL・L-1 双氧水阻断内源性过氧化物酶，正常血清封闭37℃，30min，分别加cyclin D1单抗和CDK4羊抗（购自Santa Cruz公司）一抗，滴加于切片上，4℃过夜，次日晨滴加生物素化的二抗和复合物（LSAB试剂盒购自DAKO公司），37℃恒温箱中各30min，各步骤均用PBS充分振洗，DAB显色，常规脱水、透明、树脂封片.染色过程中，严格控制显色时间和温度，3组在同一时间、同一条件下、同批处理.
1.3 cyclin D1/CDK4阳性细胞表达及定量 cyclin D1与CDK4在细胞中的阳性信号均为覆盖胞质、胞核的棕黄色颗粒，用免疫组化定量测量系统，对3组进行测量.每次测量前，都以同一空白片作标准，调整系统光度至设定的标准灰度.在同一灰度条件下，对3组标本上皮的基底层和棘细胞层进行自动测量，避开上皮的角化层和鳞癌癌巢中心的角化区.每张片子选择5个不同的视野，用鼠标按照上皮的形态画出测量区，自动测量，选平均灰度为测量指标.系统设定白色最大灰度为256，黑色最小灰度为0，灰度值越小，说明其阳性反应程度越高.
统计学处理:用统计分析软件进行显著性方差分析（ANOVA）比较分组间的差别，Spearman和Pearson相关分析SCC组的分级与cyclin D1和CDK4，以及cyclin D1与CDK4的相关性.
2 结果
2.1 cyclin D1和CDK4免疫组化结果 在3组中cyclin D1与CDK4均有阳性反应，N组呈弱阳性，主要集中在棘细胞层，反应强度基本一致，IF组中反应强度不一，部分细胞阳性反应较强，也以棘细胞层染色为主，两组角化层均呈阴性反应.SCC组中cyclin D1阳性表达很强（Fig1），为强阳性反应，不同细胞分化的组织中阳性表达也存在较大差异，中度分化和低分化鳞癌以及有转移、复发的病例阳性表达程度最高.CDK4在3组中的阳性表达结果与cyclin D1相似，N组和IF组中的表达较弱，主要分布在上皮的棘细胞层，以覆盖胞核、胞质的棕黄色颗粒为阳性信号，鳞癌组的组织细胞增生活跃，CDK4阳性表达很强（Fig2），不同细胞分化的组织间阳性表达也存在差异.定量结果见Tab1，2.
图1 －图2 略
表1 各组间cyclin D1和CDK4阳性反应的定量结果 略
2.2 统计分析结果 ANOVA统计结果表明，在平均灰度水平上cyclin D1和CDK4的表达在SCC组与N，IF组间均有显著性差异（P&<0.05）;cyclin D1与CDK4在SCCⅠ，SCCⅡ和SCCⅢ间也有显著性差异（P&<0.05）.相关性分析表明cyclin D1与CDK4的表达间有显著的正相关关系（r=0.4684，P=0.0052）;CDK4平均灰度与鳞癌分级之间呈负相关趋势（r=-0.3152，P=0.0702）.
表2 cyclin D1和CDK4在SCC分级间的平均灰度定量结果 略
3 讨论
正常细胞的生长、代谢具有一定的顺序和周期性，细胞分裂的调控对于多细胞生物是至关重要的.目前认为细胞周期蛋白通过cyclin-CDK-CKI的网络调控实现对细胞周期的调节.细胞周期中有两个关键的节点（check point）控制着细胞能否进入下一个分裂时相，一个是G1-S期（也被称为起始点），一个位于G2-M期，其中与G1-S期联系最紧密的是cyclin Ds与CDK4/CDK6，细胞周期蛋白D的分子质量为33～34ku，分为3个亚类D1，D2和D3，又分别位于人11q13，12q13和6q21上的Bcl-1，CL-ND2/Vin-1和CLND3基因编码［3］ ，cyclin D作为细胞周期的正性调控因子，使细胞由G1期越过S期，这种作用尤以cyclinD1为代表，cyclin D1在G1期的这种正性调控作用是通过cyclin D1与细胞周期蛋白依赖激酶CDK4/CDK6结合并使之激活，活化的CDK4/CDK6又使pRb（视网膜母细胞瘤蛋白）在G1-S转换期发生磷酸化，从而使E2F从pRb抑制下解离，进一步激活这些基因的表达、启动DNA复制，推动细胞从G1期进入S期［4］ .
我们的结果显示，cyclin D1与CDK4在口腔颊部鳞癌中有强阳性表达，而且它们的表达具有协同性的特点.这些结果说明肿瘤细胞的增殖旺盛，与其生长失控的特点吻合，作为对照的正常组和非特异性炎症组中的细胞处于正常的细胞增殖状态，其表达cy-clin D1与CDK4的水平明显低于鳞癌组，而且cyclinD1作为cyclin-CDK4-CDI网络的正性调控亚基，在 鳞癌细胞中与CDK4均有强阳性表达，这一结果可能在口腔粘膜的癌变机制中占有重要的地位，它们的基因扩增或突变，导致其表达产物的质和量的改变，从而引起细胞增殖分裂加速，进入一种失控的无限增殖状态.结果同时显示CDK4与鳞癌分级有相关趋势，虽样本量较小，但结果仍可提示CDK4可作为肿瘤患者病理分级或作为预后评价的辅助指标之一.
研究结果表明，口腔颊部粘膜不同性质的病损中cyclin D1与CDK4的表达有明显的趋势性，即在鳞癌组阳性反应程度最高;而且分化不同的鳞癌中又以Ⅲ级鳞癌组的阳性水平最高;同时cyclin D1与CDK4的表达具有协同性的特点从一个侧面揭示了口腔粘膜上皮癌变中cyclins及CDKs在细胞增殖周期及口腔粘膜癌变中的作用.
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