作者：惠延平 黄高升 王文亮 王映梅 朱晓慧 马福成
【关键词】 胃肿瘤
关键词: 胃肿瘤;癌前状态;基因表达;免疫组织化学
摘 要:目的 探讨胃癌及其癌前病变中ras，c-erbB-2，p53癌基因蛋白产物的表达分布特点及其在胃癌发生发展中的作用. 方法 应用免疫组化ABC方法，对58例胃癌、31例胃粘膜上皮异型增生和11例正常胃粘膜组织中，鼠抗人mAb ras基因p21蛋白、兔抗人c-erbB-2原癌基因产物多克隆抗体p185，鼠抗人mAb p53蛋白进行了检测. 结果 p21在正常胃粘膜和轻、中、重度异型增生和胃癌中的表达率分别为27.3%，30.0%，46.2%，75.0%和72.4%;其表达率在重度异型增生和胃癌中显著高于正常胃粘膜和轻、中度异型增生（P&<0.05）;p185在正常胃粘膜和轻、中度异型增生中无表达，在重度异型增生和癌中的阳性表达率分别为25.0%，18.9%，各组间无显著性差异（P&>0.05）;p53仅在癌中有表达，表达率29.3%，明显高于非癌组织（P&<0.05）.胃癌中两种以上癌基因蛋白同时表达率明显高于非癌组织（P&<0.05）. 结论 ras基因可能作用于胃癌发生的早期阶段，c-erbB-2，p53基因可能作用于胃癌发生的较晚期.并认为胃癌发生需要多基因协同作用.
Keywords:stomach neoplasm;procancerous condition;gene expression;immunohistochemistry
Abstract:AIM To investigate the expression and distribu-tion features of p21，p53and p185oncoproteins in gastric cancer and its precancerous lesions.METHODS Immuno-histochemical method was used to measure tissues of58gas-tric cancer and31gastric mucosa dysplasia.RESULTS Pos-itive rate of p21in mild，moderate，severe dysplasia and can-cer of stomach was3/10（30.0%），6/13（46.2%），6/8（75.0%）and42/58（72.4%）respectively;the positive rate of p185in severe dysplasia and cancer of stomach was2/8（25.0%）and11/58（18.9%）resprectively;p53expression was only in cancer17/58（29.3%）.The positive percentage of ras p21in severe dysplasia was significantly higher than that of normal mucosa or mild dysplasia（P&<0.05），ap-proaching the level in carcinoma（P&>0.05）.The positive ex-pression percentage of p53in gastric carcinoma was signifi-cantly higher than that of non-carcinomarous tissue（P&<0.05）.There were more than two kinds of oncogenes overex-pressed in gastric carcinoma（P&<0.05）.CONCLUSION Over-expression of p21，p185，p53may play an important role in the onset and development of gastric carcinoma;the ras gene product may be correlated to the events happenning in the early period of gastric carcinogenesis，while p185and p53gene proteins may be related to the later period of gastric carcinogenesis.It is also suggested that severe dysplasia has already possessed some characteristics of carcinoma and the development of a gastric carcinoma needs the synergistic ac-tion of several oncogenes.
0 引言
胃粘膜上皮异型增生是胃癌的一种重要癌前病变，它与胃癌发生关系密切［1］ .研究胃粘膜从癌前病变到癌这一发展过程中细胞内癌基因的变化，对揭示其内在联系和阐明胃癌的发生机制有重要意义.尽管人们对胃癌中癌基因的研究给予很大关注［2-7］ ，但对癌前病变中癌基因的表达，尤其是多癌基因协同作用的研究较少.我们应用免疫组化方法检测了11例正常胃粘膜，31例胃粘膜上皮异型增生和58例胃癌中ras，c-erbB-2，p53癌基因蛋白的表达和分布，分析其相互关系及其在胃癌发生发展过程中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 58例胃癌，其中高分化腺癌27例，低分化腺癌10例，粘液腺癌6例，印戒细胞癌11例，未分化癌4例系唐都医院1995-01/1995-12外科手术切除标本，31例胃粘膜上皮异型增生为慢性萎缩性胃炎的伴随病变，根据其异型增生程度分轻度10例，中度13例，重度8例，另11例正常胃粘膜系同期纤维胃镜胃粘膜活检标本.全部经病理检查确诊并进行2a以上随访观察.胃癌诊断标准参照1980年全国胃癌协作会议制定的标准［8］ ，异型增生诊断标准参照全国胃癌协作组病理组制定的三级方案［8］ ，所有新鲜标本经40g・L-1 甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，制成4μm厚连续切片.
1.2 免疫组织化学方法 鼠抗人mAb ras基因p21蛋白工作浓度1∶40，兔抗人c-erbB-2原癌基因产物多克隆抗体p185工作浓度1∶100，鼠抗人mAb p53蛋白工作浓度1∶40，生物素化马抗鼠IgG，羊抗兔IgG，均为Dako公司产品，ABC试剂盒为Vector公司产品.3种癌基因产物染色方法均采用ABC法.染色程序按试剂盒说明操作.以PBS代替-抗作空白对照，用已知的待检抗体检测阳性的切片作阳性对照. 1.3 结果判断 显微镜下观察细胞膜、细胞质内或（和）核内有棕黄色显色者定为阳性细胞.观察切片中10个具有代表性的高倍视野，阳性细胞数小于10%定为（-），大于10%为（+）.
统计学处理:阳性率比较采用χ2 检验.
2 结果
2.1 3种癌基因蛋白在阳性细胞中的分布 p21，p185癌基因蛋白阳性表达主要在胞质或（和）胞膜（Fig1，2）.p53蛋白阳性细胞染色部位主要在胞核，少数在胞质同时也有少量表达（Fig3）.阳性细胞分布形式呈弥漫、灶状或散在3种.
图1 －图3 略
2.2 3种癌基因蛋白在正常胃粘膜、异型增生及胃癌中的表达 胃癌及胃粘膜良性病中显示:p21蛋白的阳性表达率在重度异型增生和胃癌组明显高于正常粘膜和轻度异型增生组（P&<0.05），其他各组间无显著性差异;p185蛋白的阳性表达率在各组间无显著性差异;p53蛋白阳性表达率在胃癌组明显高于正常胃粘膜及各级异型增生组（P&<0.05，Tab1）.不同组织类型胃癌中显示p21蛋白的阳性表达率在高分化腺癌明显高于低分化腺癌（P&<0.05），其他各组织类型胃癌间无显著性差异;p185，p53蛋白的阳性表达率在各组织类型胃癌中均无显著性差异（Tab2）.
2.3 3种癌基因蛋白在胃粘膜异型增生及癌中表达的相互关系 34例正常胃粘膜、轻度和中度胃粘膜异型增生中，p21蛋白单独表达12例，p185和p53蛋白无表达;8例胃粘膜重度异型增生中p21蛋白表达6例，其中2例伴有p185蛋白同时表达，p53蛋白无表达.58例胃癌中，6例同时表达3种癌基因蛋白，14例同时表达p21与p185蛋白或p21或p53蛋白，2例p53蛋白单独表达，22例p21蛋白单独表达，p185蛋白无单独表达，经χ2 检验，2种以上癌基因蛋白同时表达率在胃癌明显高于非癌组织（P&<0.05）.
表1 胃癌和胃粘膜良性病变中p21，p185，p53蛋白的阳性表达 略
表2 不同组织类型胃癌中p21，p185，p53蛋白的阳性表达 略
2.4 癌基因蛋白阳性表达与胃癌术后生存时间的关系 2a以上随访，42例正常和各级异型增生胃粘膜病例，未发现1例癌变.58例胃癌术后患者，获得随访结果21例，生存期大于2a者9例，其中2例3种癌基因蛋白同时表达，2例为p21和p185蛋白同时表达，5例单独表达p21蛋白.小于2a生存者12例，其中同时表达p21和p185或p21和p53两种癌 基因蛋白各3例，3例单独表达p53蛋白，2例单独表达p21蛋白，另有1例3种癌基因蛋白均阴性，无统计学意义.
ras基因编码相对分子质量为21×103 的蛋白，通常称p21.p21蛋白位于细胞膜内面，具有鸟苷酸结合能力和GTP酶活性.ras基因突变可扰乱细胞代谢和信号传递通路，刺激生长或分化，可导致细胞的恶性转化［3，4］ .c-erbB-2基因编码相对分子质量为185×103 的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，可能起膜受体作用，检测p185可反映c-erbB-2基因状态［5］ .p53基因为一种抑癌基因，编码53×103 的核蛋白.失活后的p53基因编码产物能提高细胞增殖能力，在肿瘤形成中起重要作用［6，7］ .胃癌发生的早期阶段，胃粘膜组织常可呈不同于正常细胞的形态学、免疫学、组织化学和代谢等改变，这些灶性损伤被认为是癌前病变，最常见的癌前病变即为胃粘膜上皮异型增生［1］ .这些异型增生的胃粘膜细胞基因表达水平的改变与胃癌的发生是否存在某些内在联系?有研究发现正常胃粘膜和胃良恶性病变中p21蛋白有一定程度的表达［3，4］ ，p185，p53蛋白一般认为仅在胃癌中表达［2，5-7］ .有关胃癌前病变及胃癌多基因协同作用的研究较少见［9，10］ .
我们重点观察了p21，p185和p53癌基因蛋白在胃癌前病变及癌中的表达规律.发现p21蛋白在正常胃粘膜、轻、中、重度异型增生至癌均有表达，其阳性表达率随病变加重逐级增高.这一现象提示ras基因可能具有某些特殊生理机能.胃粘膜在正常生理状态具有旺盛的更新、再生能力，这也许是正常胃粘膜p21蛋白表达的原因.推测病理状态下，细胞损伤持续存在，DNA合成活跃，使ras基因出现激活和过表达，当损伤过重时，ras基因蛋白过表达发生了质和量的改变，或有其他癌基因参与，进而导致突变细胞向恶性细胞转化.本组p21蛋白阳性表达率在重度异型增生明显高于正常粘膜和轻度异型增生（P&<0.05），并与癌接近（P&>0.05），这一结果支持p21蛋白的异常表达与胃癌发生的早期阶段有密切联系.p185在正常胃粘膜和轻、中度异型增生中无表达，在重度异型增生和癌中出现表达.p53蛋白表达只出现在胃癌，提示p185，p53蛋白过表达主要作用在胃癌发生的较晚期.
3种癌基因蛋白在不同组织类型胃癌中的表达率略有不同，p21蛋白在高分化腺癌中的表达率高于低分化腺癌（P&<0.05），p185蛋白在高分化腺癌、粘液腺癌中表达率较高，p53蛋白在未分化癌中有较高的表达.这一结果也反映了癌基因蛋白过表达与肿瘤分化程度有关.我们还发现42例非癌胃粘膜，主要为p21单一基因蛋白表达，仅两例重度异型增生出现2种癌基因蛋白同时表达，58例胃癌中，其中20例2种或3种癌基因蛋白共同表达.胃癌中2种以上癌基因蛋白同时表达率显著高于非癌组织（P&<0.05）.提示胃癌的发生、发展往往需要多基因激活的协同累积作用，不同的癌基因可能作用于不同的致癌阶段.随访结果提示多基因激活不仅有协同作用，可能还具有相互制约作用.p53蛋白高表达可能预示预后不良，因病例太少，统计学处理无意义，有待于进一步工作.
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