作者：姚文柱 胡家露 吴开春 崔大祥
【关键词】 转化生长因子
关键词: 转化生长因子;肠粘膜/损伤;修复;抗体
摘 要:目的 动态观察转化生长因子（TGF）在不同肠粘膜病理状态下的表达，探讨TGF在肠粘膜损伤后修复过程中所起的作用. 方法 以巴西日圆线虫（Nippostrongylus bras-iliensis，Nb）感染大鼠建立肠粘膜损伤修复模型，手术取出不同感染阶段大鼠小肠肠段，标本冰冻保存，切片.应用免疫组织化学染色方法检测TGF的表达. 结果 在大鼠肠粘膜感染Nb后发生的损伤至修复过程中，TGFα，TGFβ1的表达发生了明显的规律性的变化，即TGFα先是表达于肠绒毛隐窝区域的上部，接着逐渐向肠绒毛的顶端区域转移;而TGFβ1先是主要表达于肠绒毛的顶端部位及隐窝区域的上部，随之顶端部位的表达逐渐减少，最后主要定位表达于隐窝区域的上部.固有膜内TGFα，TGFβ1也有表达，但粘膜损伤前后及修复过程中，其表达强度及部位无明显变化. 结论 TGFα，TGFβ1在粘膜损伤后可能通过在粘膜上皮细胞表达部位的变化，促进细胞分化、迁移和增殖，与粘膜损伤后修复关系密切.
Keywords:transforming growth factor;intestinal mucosa/iusures;ristitution;antibody
Abstract:AIM To investigate the role of TGFαand TGFβduring the all course of the restitution of wounded gastroin-testinal epithelia after injury in vivo.METHODS Rat small intestine was infected with Nippostrongylus brasiliensis（Nb）as the model of epithelia injury-and-restitution.Rat intestinal fragments were obtained surgically and preserved frozen，and then sliced up.The expression of TGFαand TGFβwas as-sessed by immunohistochemistry.RESULTS An expansion of the proliferative compartment and increased turnover of in-testinal epithelial cell were seen in rat intestine of this model.Expression of TGFαand TGFβpeptides was shown in both the epithelial cell and lamina propria compartment.Different patterns of TGFαand TGFβ1expression were seen within the epithelium cell of rats with intestinal injury and restitution compared with untreated controls.In control groups，the strongest staining was present in epithelia cells located on the villus tips for TGFαand upper cypt regions for TGFβ1.After Nb infection，the expression of TGFαwas seen in the upper crypt regions first and migrated towards the villus tips which was consistent with the process of restitution;On the con-trary，the expression of TGFβ1was seen in the villus tips first and migrated towards the upper crypt regions conse-quently.The expression of these peptides within lamina pro-pria was not changed.CONCLUSION Epithelial restitution is associated with compensatory changes in expression of TGFαand TGFβ1in the epithelial cell compartment while the lamina propria does not seem to be significantly affected.
0 引言
体外TGFα，TGFβ1对肠道粘膜损伤后修复的调节作用已有多篇文献付诸报道［1］ ，且结论趋于一致:这两种生长因子对细胞的增殖有一种互相影响的平衡调节作用.通过对肠道粘膜上皮细胞株系的研究发现，TGFα可以刺激、促进上皮细胞的增殖，而同时TGFβ1是一个潜在的抑制因素［2］ ;另外，它们均可以调节上皮细胞的其他功能，如TGFα调节电解质及营养成分的摄取［3］ ，TGFβ1在调节细胞外基质的产生过程中起着关键作用［4］ .但在体内的研究却很少［5］ ，为了探讨粘膜损伤后愈合过程中这两种因子的作用，我们设计了一种动物模型，旨在观察在粘膜损伤后至愈合过程的不同阶段，TGFα，TGFβ1有无表达、表达部位及表达程度的变化，完善TGFα，TGFβ1对粘膜上皮调整作用的体内研究.
1 材料和方法
1.1 材料 兔抗鼠TGFα，TGFβ1，多克隆抗体博士得公司;ABC Kit博士得公司;DAB Sigma公司;正常羊血清，华美生物公司;APES，武汉博士得公司;SPF大鼠;巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasilien-sis，Nb）.
1.2 方法 6周龄雌性SPF大鼠饲养于空气层流净化间，大鼠饮用水经高压消毒，饲料经60 CO照射使用.实验用大鼠分为5组，每组5只.大鼠皮下接种Nb幼虫6d后获取成虫，按500条成虫/只外科剖腹法用18号针头注入大鼠幽门后5cm十二指肠处，建立肠粘膜损伤修复模型;分别接种Nb成虫后4，8，12和16d，用过量乙醚麻醉致死大鼠，获取距幽门20cm处肠段2cm，液氮保存，冰冻切片.正常大鼠十二指肠处注入生理盐水作为对照.ABC免疫组化染色步骤:取出冰冻切片，室温放置15min;3mol尿素中浸泡30min，PBS洗涤5min;10mL L-1 h3 O2 中浸泡30min，PBS振荡洗涤3×5min;10mL L-1 正常羊血清封闭切片15min;加兔抗鼠TGF mAb（1 100），4℃反应24h，PBS浸洗3×5min;加生物素二抗（1 200），37℃温育1h，PBS浸洗3×5min;加ABC复合物，37℃温育1h，PBS浸洗3×5min;加0.5g L-1 DAB（含DAB/h3 O2 过氧化氢显色，显微镜下控制时间，水洗5min;苏木素衬染，系列乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片.用正常羊血清替代一抗做阴性对照，用已知阳性片重复染色做阳性对照.免疫组化染色结果判定以组织、细胞中棕色或棕褐色颗粒为阳性，每张切片取5个高倍视野，根据阳性细胞的多少分为+（&<30%）， （30%～60%）， （&>60%）3级.
统计学处理:χ2 检验，显著性界限定为P&<0.05.
2 结果
未经Nb感染的正常大鼠肠粘膜上，TGFα主要表达于肠绒毛的顶端，TGFβ主要表达于肠绒毛隐窝区域的上部;感染Nb后，TGFα则先是主要表达于肠绒毛隐窝区域的上部，逐渐向肠绒毛的顶端上移，而TGFβ主要表达于肠绒毛的顶端区域，且渐移向肠绒毛隐窝区域的上部.固有膜内TGFα，TGFβ1也有表达，但粘膜损伤前后及修复过程中，其表达强度及 部位无明显变化.不同病理情况下TGFα，TGFβ1表达强度及分布见Tab1，2.
表1 不同病理情况下TGFα的表达强度及分布 略
表2 不同病理情况下TGFβ的表达强度及分布 略
3 讨论
3.1 正常大鼠肠粘膜TGF的表达 本研究中，所有正常大鼠肠粘膜标本TGFα，TGFβ免疫组化染色显示，TGFα主要表达于肠绒毛的顶端，TGFβ主要表达于肠绒毛隐窝区域的上部.与Dignass等［6］ 研究结果一致.说明生理情况下，TGFα，TGFβ对于维持肠粘膜上皮的代谢平衡起着重要的调节作用.关于其机制目前尚不十分清楚.现在大家认为，整个胃肠道粘膜细胞均可产生TGFα，先是以160AA的前体分子散布于细胞表面，若是遇到特异性蛋白分子刺激后，则以50AA的分子形式释放.
3.2 不同病理状态情况下TGF的表达 在不同病理状态情况下，5组20例标本的免疫组化结果显示:在大鼠肠粘膜感染Nb后发生损伤至修复过程中，TGFα，TGFβ1的表达发生了明显的规律性的变化，即TGFα先是表达于肠绒毛隐窝区域的上部，接着逐渐向肠绒毛的顶端区域转移;而TGFβ先是主要表达于肠绒毛的顶端部位及隐窝区域的上部，随之顶端部位的表达逐渐减少，最后主要定位表达于隐窝区域的上部.既往实验说明，TGFα对于多种细胞株具有营养作用，应用TGFα可以减少乙醇或应激等引起大鼠发生溃疡的危险.TGFα具有维持粘膜表皮完整性的作用，其机制可能主要通过促进细胞分化与迁移，而非分裂.体外培养的肠粘膜细胞单细胞层经过划伤等方法可以造成粘膜损伤模型，若在培养基中加入TGFβ1，则可以明显加速划伤边缘的细胞向缺损区域迁移、延伸，若同时加入TGFβ1和抗TGFβ1，则上述现象不会发生.Dignass等［1］ 在一组实验中同时观察了TGFα，TGFβ1，IL-1，IL-6，EGF，PDGF，TNFα，IFNγ等多种细胞因子对粘膜损伤模型中粘膜上皮细胞的作用，说明TGFβ1肯定具有促进细胞迁移的作用.Yanaka等［8］ 通过测定电阻抗和渗透性的方法，利用豚鼠胃粘膜体外损伤修复模型观察了TGFβ1的作用，发现TGFβ1具有明显促进粘膜损伤愈合的功能，但是若有Ⅳ胶原抗体存在，TGFβ1的作用则延迟;该结果提示TGFβ1很可能通过促进Ⅳ胶原的合成和沉积，从另一角度促进粘膜创伤的愈合.Wahl［7］ 也观察到，如果皮下注射TGFβ1，可以导致损伤区域的炎性细胞浸润，诱发血管生成和纤维化，促进胶原和细胞外基质的沉积.所以说，假如要确定一种细胞因子为影响损伤愈合的最关键的因子的话，那么该因子无 疑是TGFβ1.
3.3 固有膜内TGFα，TGFβ1的表达 固有膜内TGFα，TGFβ1也有表达，但粘膜损伤前后及修复过程中，其表达强度及部位无明显变化.说明TGFα，TGFβ1在粘膜损伤前后及修复过程中主要可能依靠自分泌或旁分泌的形式来调节粘膜细胞的生物学功能.固有膜内的TGFα，TGFβ1对粘膜细胞的增殖和分化影响较小.
参考文献
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［3］Carolina C，Stuart E，Daniel K.Trasforming growth factorβregulation of migration in wounded rat intestinal epithelial monolayers ［J］.Gastroenterology，1993;105（2）:93-101.
［4］Yanaks A，Muto H，Fukutomi H，Ito S，Silen W.Role of transforming growth factor beta in the restitution of injured guinea pig gastric mucosa in vitro ［J］.Am J Physiol，1996;271（1Pt1）:G75-G85.
［5］Ono I，Gunji H，Zhang JZ，Kanero F.A study of cytokines in burn blister fluid related to wound healing ［J］.Burns，1995;21（5）:352-355.
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［7］Whal SM.The transforming growth factorβin inflammation:A cause and a cure ［J］.J Clin Immunol，1992;12（1）:61-74.［8］Yanaka A，Muto H，Fukutomi H，Ito S，Silem W.Role of transforming growth factorβin the restitution of the injured guinea gastric mucosa in vitro ［J］.Am J Physiol，1996;271（1）:G75.