犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培养方法改良探索

　　　　 作者：苏冠华，刘启云， 卢永昕， 米少华， 孙雨霏， 刘晓明，帅欣欣

【摘要】 　　目的: 探讨犬骨骼肌成肌细胞（SkMs）体外分离、 纯化及培养方法的改良并研究其生物学特性。方法: 采用机械分离结合Ⅱ型胶原酶、 中性蛋白酶双酶一步消化法分离犬骨骼肌成肌细胞， 经差速贴壁法纯化后， 在骨骼肌细胞生长培养基（SKGM）中进行原代和传代培养， 免疫细胞化学染色鉴定。结果: 改良后的培养方法适于获取犬骨骼肌成肌细胞， SKGM培养基适于犬骨骼肌成肌细胞的体外培养。SkMs在细胞密集或低血清分化培养基作用下可融合成肌管。结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）细胞化学染色鉴定SkMs呈阳性， 纯度在90%以上。结论: 通过改良后的双酶一步消化法获得的SkMs在合适的培养条件下能够增殖、 分化并保持其生物学特性， 为其在基因治疗和组织工程中的应用奠定了基础。

【关键词】 犬; 骨骼肌成肌细胞; 细胞培养; 生物学特性

　　1961年， Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现了具有自我更新和分化形成肌纤维能力的肌卫星细胞（muscle satellite cells）。从骨骼肌中分离获得的肌卫星细胞在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblasts， SkMs)。来源于骨骼肌的成肌细胞具有取材方便、 免疫源性低、 植入后容易与宿主的肌纤维融合、 体外培养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、 转染外源基因的成肌细胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点［1］。因此， 成肌细胞被广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。本研究以获取基因治疗载体SkMs为目的， 探讨建立简便、 经济的成肌细胞分离、 纯化及培养方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　实验犬由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。中性蛋白酶购自美国Roche公司， Ⅱ型胶原酶、 结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）购自美国Sigma公司; SKBM培养基和SKGM Bullet Kit购自美国Lonza公司; 亲和素生物素过氧化物复合物法（avidinbiotin complex， ABC）免疫组化试剂盒购自美国Vector公司， DAB 显色试剂盒购自武汉博士德公司; 胰蛋白酶、 DMEM、 M199培养基购自美国Hyclone公司; 胎牛血清（Fetal Bovine Serum， FBS）， 小牛血清购自美国Gibco公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 SkMs的原代培养

　　完全生长培养基70SKGM各成分按以下比例SKGM∶DMEM∶FBS＝70∶25∶5配制。无菌全麻下自5～8 kg左右杂种犬股四头肌取3～5 g肌肉， 将其移入盛有PBS的90 mm培养皿中剔除筋膜、 脂肪、 肌腱和血管组织后剪为碎糜状， 将组织块移入盛有约30 mL的4 g/L中性蛋白酶和1 g/L Ⅱ型胶原酶混合消化酶溶液的100 mL玻璃瓶中， 37℃恒温摇床60 r/min， 1 h。然后吸取9 mL上清液经孔径75 μm的不锈钢网筛（200目）过滤到10 mL玻璃离心管中， 再加入1 mL FBS中和， 1 000 r/min， 离心5 min， 弃上清。加70SKGM培养基重悬细胞沉淀， 种入明胶预包被的培养瓶。再加入双酶溶液重复消化上述剩余的组织块， 反复3～4次。计数、 台盼蓝染色确认细胞成活率。2 d 后换液， 以后每2～3 d换液1次， 在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。

　　1.2.2 SkMs的传代培养及纯化

　　倒置显微镜下观察细胞生长情况， 当细胞生长到培养瓶面积的70%～80%时， 以2.5 g/L胰蛋白酶+ 0.2 g/L EDTA混合溶液消化， 中止消化后离心， 重悬细胞后将细胞悬液接种另一培养瓶， 静置于培养箱内约8～10 min后取出， 轻轻晃动培养瓶， 动员未贴壁的细胞， 吸出培养液接种另一培养瓶， 反复差速3次。最后按1∶2或1∶3比例进行传代， 每2～3 d换液1次。4 g/L台盼蓝染色确认细胞成活率。

　　1.2.3 SkMs细胞生长曲线测定

　　取处于对数生长期的细胞， 用上述EDTA/胰酶溶液消化后制成单细胞悬液， 细胞计数后以5×103细胞/孔接种于24孔板， 共接种8组， 每组3孔， 每天取一组细胞进行计数， 计算平均值， 连续8 d， 绘成细胞生长曲线。未计数孔细胞每2～3 d换液1次。

　　1.2.4 SkMs的诱导分化

　　取培养至第2～3代的细胞， 消化后以1×105细胞/孔接种于放有盖玻片的6孔培养板中， 加入生长培养基进行培养， 待细胞分裂、 增殖至70%～80%汇合后， 加入分化培养基（含200 mL/L FBS的M199培养基）继续培养， 倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况。

　　1.2.5 SkMs的免疫细胞化学染色
　　
　　将细胞接种于有盖玻片的6孔板， 待长至培养面积的80%取盖玻片。40 g/L多聚甲醛固定后， 以ABC法行免疫化学染色， 以鼠抗desmin mAb为一抗， DAB显色。

　　1.2.6 差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞desmin阳性数比较

　　取等量的第2代细胞悬液种于25 cm2培养瓶， 差速贴壁纯化组与非差速贴壁组各2瓶， 制作细胞爬片行desmin免疫化学染色。每组取4片， 每片随机取5 个视野进行采样， 以Olympus BX50 显微摄像系统进行阳性细胞计数， 所得数据以χ2检验进行统计学处理。

　　2 结果

　　2.1 SkMs体外培养的生物学特点

　　经酶消化分离出的成肌细胞为圆形小亮点， 悬浮于培养液中。有活力的细胞能够在48 h内完全贴壁， 变扁并向四周伸展而成为一梭形或纺锤形细胞， 有折光性（图1A）。约3～4 d后进入对数生长期（图1B）， 6～7 d后因接触抑制生长速度减慢。细胞增多后逐渐按一定方向呈有序排列。　

　　2.2 骨骼肌成肌细胞体外培养的鉴定

　　2.2.1 多核肌管形成

　　在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度时， 可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管（图2）。

　　2.2.2 desmin细胞免疫化学染色

　　差速纯化后培养的成肌细胞经desmin进行免疫化学染色（DAB显色）， 成肌细胞胞质呈阳性反应， 细胞核外周及胞质呈棕黄色， 表明培养的细胞为成肌细胞（图3）。多核肌管呈强阳性。

　　2.3 成肌细胞生长活性测定和生长曲线的绘制

　　原代细胞进行台盼兰染色， 结果发现97%以上的细胞均不着色， 表明本实验方法培养的细胞存活率高。细胞连续计数所绘制的成肌细胞生长曲线显示: 细胞在培养的3～5 d增殖达高峰， 5～7 d后基本达生长平台期。

　　2.4 成肌细胞的差速纯化

　　将差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞进行desmin免疫化学染色， 发现两组阳性细胞数有显著差异， 经计算得χ2值为5.47， P&<0.05为具有统计学意义。

　　3 讨论

　　SkMs是位于骨骼肌纤维膜与基底膜之间的组织干细胞。当骨骼肌受损伤时， 可被启动形成新的骨骼肌纤维［2］。一般来讲， 肌肉来源的动物越老， 分离肌肉细胞所需要的时间越长， 而且单个核前体细胞的产量也越低。国内大多数研究取成年犬的骨骼肌组织坚韧， 同时由于成肌细胞量少， 提取困难。本实验综合国内外研究经验， 采用了约5～8 kg的未成年犬进行原代培养， 产量较高。目前提取犬成肌细胞大多采用机械分解法结合三步消化法［3］（I 型胶原酶， 透明质酸酶， 链霉蛋白酶）或二步消化法［4］（I 型或IV 型胶原酶+胰蛋白酶）获得单细胞悬液， 步骤繁琐， 成本均较高。蛋白水解酶如胰蛋白酶， 链霉蛋白酶等往往还存在可能损伤细胞、在孵育的过程中不稳定、可能成为支原体污染的来源等缺点。而中性蛋白酶则能够克服以上缺点。故本研究创新性地采用中性蛋白酶/Ⅱ型胶原酶混合酶溶液一步消化法， 大大简化了流程并以较少的代价获得足量的原代成肌细胞。研究认为， 原代细胞中混有大量的成纤维细胞， 既往为提高纯度往往采用不连续密度梯度离心法［5］、免疫磁珠分离法［6］、不完全消化法等方法， 但均以操作复杂、产量低或价格昂贵为代价。差速贴壁操作方法简单有效， 具有很大的适用性。原理是利用成纤维细胞的贴壁能力强于成肌细胞， 10 min左右即可贴壁， 而成肌细胞多数仍处于悬浮状态， 此时移出培养液， 即为纯化的成肌细胞。本实验中采用3次预贴壁， 每次10 min进行差速纯化获得的成肌细胞经鉴定阳性率均在90%以上， 符合组织工程基因治疗的纯度要求。

　　据已有文献报道， 不同种属动物SkMs的最佳培养条件不同。目前犬SkMs常用的生长培养基有M199， MEM， DMEM， F12以及RPMI1640等。SkMs体外增殖、分化除受血清浓度改变的影响之外， 还要受到多种因子的调节， 如胰岛素、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EDF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）等。研究证实［7］， 在不含任何生长因子的DMEM、M199等生长培养基进行培养时， 原代细胞中混杂的成纤维细胞迅速生长， 并随着传代次数的增多呈几何级数增长逐渐占据优势。包含特定生长因子的生长培养基更适合于SkMs的增殖培养。SKGM 培养基中含有胰岛素， EGF， 地塞米松等成分则可明显地促进成肌细胞的增殖、生长。因此， 本课题组在国内首次采用了SKGM培养基进行原代培养， 结果发现成肌细胞逐渐呈现选择性生长优势并成为原代培养物中的主导细胞类型， 并且随着时间延长， 肌源性细胞逐渐增多， SkMs的纯度和增殖活力明显优于M199、DMEM等其他传统的生长培养基。
　　
　　成肌细胞在长轴方向融合， 形成细胞核在中央， 肌丝在周边的多核肌管是鉴定的重要依据。本研究在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度时， 可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管， 初步证明成肌细胞体外培养成功。同时， 肌管可以有一些粗短的分支， 这一点与心肌组织的发育相类似， 也提示骨骼肌来源的成肌细胞可以作为心肌组织的前体细胞用于心肌组织工程研究。结蛋白（desmin）是肌细胞内细胞骨架中间丝的构成成分之一， 它是最早表达的肌源性标志蛋白［8］。用免疫细胞化学染色方法检测细胞有无desmin表达是目前所知的鉴定SkMs的最佳方法。本实验研究采用desmin染色显示， SkMs呈阳性， 而多核肌管呈强阳性。
　　
　　成肌细胞是哺乳动物体内惟一能大量分裂、增殖及迁移的前体细胞， 具有与宿主肌纤维融合的能力， 可作为一种有效载体广泛用于目的基因的转移。目前已经通过基因工程获得能表达人类Ⅸ因子（hFⅨ）、人生长激素（hGH）、红细胞生成素（EPO）、 克隆形成刺激因子（CSF1）及IGF等基因产物的成肌细胞株。利用组织工程技术将基因修饰的SkMs塑形为生物人工肌肉， 目前已发展成为一种新型基因治疗载体。本课题组已成功将其应用于小鼠后肢缺血模型， 大鼠心梗后心力衰竭模型的基因治疗［9］。因此， 简单、经济、快捷的成肌细胞获取和培养将为基因治疗和组织工程的进一步研究奠定坚实基础。

参考文献

　　［1］Yao SN， Kurachi K. Implanted myoblasts not only fuse with myofibers but also survive as muscle precursor cells［J］. J Cell Sci， 1993， 105(Pt 4): 957-963.

　　［2］Hughes SM， Blau HM. Migration of myobasts across basal lamina during skeletal muscle development［J］. Nature， 1990， 345(6273) : 350 -353.

　　［3］Fouts K， Fernandes B， Mal N， et al. Electrophysiological consequence of skeletal myoblast transplantation in normal and infarcted canine myocardium［J］. Heart Rhythm， 2006， 3(4): 452-461.

　　［4］Hata H， Matsumiya G， Miyagawa S， et al. Grafted skeletal myoblast sheets attenuate myocardial remodeling in pacinginduced canine heart failure model［J］. J Thorac Cardiovasc Surg， 2006， 132(4): 918-924.

　　［5］Chiu RJS， Zibaitis A， Kao RL. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration with satellite cell transplantation［J］. Ann Thorac Surg， 1995， 60: 12-18.

　　［6］Périé S， Mamchaoui K， Mouly V， et al. Premature proliferative arrest of cricopharyngeal myoblasts in oculopharyngeal muscular dystrophy: Therapeutic perspectives of autologous myoblast transplantation［J］. Neuromuscul Disord， 2006， 16(11): 770-781.

　　［7］Rando TA， Blau HM. Primary mouse myoblast purification， characterization， and transplantation for cellmediated gene therapy［J］. J Cell Biol， 1994， 125(6): 1275-1287.

　　［8］LawsonSmith MJ， McGeachie JK. The identification of myogenic cells in skeletal muscle with emphasis on the use of tritiated thymidine autoradiography and desmin antibodies［J］. J Anat， 1998， 192(Pt2) : 161-171.

　　［9］Lu Y， Shansky J， Del Tatto M， et al. Recombinant vascular endothelial growth factor secreted from tissueengineered bioartificial muscles promotes localized angiogenesis［J］. Circulation， 2001， 104(5): 594-599.