pSG5/NS5A5BΔC质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

　　　　作者：王雪萍， 李富军， 邓琳， 长野基子， 北山喜久美， 堀田博

【摘要】 　　目的: 构建pSG5/NS5A5B△C质粒， 并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达。方法: 使用已经构建的pTM1NS2NS5A5B△C质粒为模板， 根据pTM1、 HCV NS5A5B△C、 pSG5序列和酶切位点特点设计引物， PCR扩增得到HCV NS5A5B△C基因片段， 将目的片段插入pSG5载体中， 经筛选阳性克隆、 SacⅠ和BglⅡ分别酶切鉴定后， 用FuGene 6转染试剂转染入Huh7细胞。用免疫荧光染色、 Western blot检测HCV NS5A5B△C在Huh7细胞中的表达。结果: 限制性内切酶SacⅠ和BglⅡ分别酶切鉴定后， 琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小和插入方向均与预计一致。荧光显微镜下可见转染的Huh7细胞表达带有绿色荧光的HCV NS5A5B△C蛋白， 该蛋白主要表达于细胞质， 表达率达40%以上。Western blot结果也证实在转染pSG5/NS5A5B△C的Huh7细胞中出现了大小与HCV NS5A5B△C (82 ku)一致的条带。结论: 成功构建了pSG5/NS5A5B△C质粒， 并在Huh7细胞中成功瞬时表达， 为进一步研究HCV蛋白的功能奠定了基础。

【关键词】 丙型肝炎病毒; 非结构蛋白5A5B; pSG5; Huh7细胞

　　［Abstract］ AIM: To construct the plasmid pSG5/NS5A5B△C， and to investigate its expression in Huh7 cells. METHODS: The plasmid pTM1NS2NS5A5B△C was taken as the template. The primers were designed according to the characteristics of the sequence and endoenzyme cleavage sites in HCV NS5A5B△C and vector pTM1， pSG5. The HCV NS5A5B△C gene fragment was amplified by PCR from pTM1NS2NS5A5B△C and inserted into vector pSG5. The positive clones were screened by Ampicillin and identified by the restriction endoenzyme SacⅠand BglⅡ digestion and agarose gel electrophoresis. The constructs were transfected into Huh7 cells with FuGene 6 reagents. Immunofluorescence and Western blot were performed to detect the expression of the constructs in Huh7 cells. RESULTS: Endoenzyme digestion analysis showed that the size and the inserting orientation of the fragment met the design expectation. Immunofluorescence staining displayed the expression of HCV NS5A5B△C protein， which was located in the cytoplasm， and the expression rate reached as high as 40%. SDSPAGE analysis showed that the relative molecular mass of the expressed product by pSG5/NS5A5B△C was about 82 ku， which was consistent with the theoretical value. CONCLUSION: pSG5/NS5A5B△C is successfully constructed， and it can be expressed transiently in Huh7 cells， which would lay a foundation for the further study on function of HCV polyprotein.

　　［Keywords］hepatitis C virus; NS5A5B; pSG5; Huh7 cells

　　HCV基因组为单股正链RNA， 核苷酸长约9.5 kb， 仅含一个开放阅读框， 翻译成一个大的聚蛋白前体， 由宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶加工成多个成熟蛋白。其中非结构蛋白NS3的相对分子质量（Mr）为70 000， 有丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性［1］， 参与聚蛋白前体加工和RNA复制过程。NS3丝氨酸蛋白酶位于NS3的N末端1/3处， 相应于HCV多蛋白aa1027至1207， 同非结构蛋白NS4A形成稳定的二聚体［2， 3］， 它以顺式方式催化NS3NS4A裂解， 反式方式催化NS4ANS4B， NS4BNS5A和NS5ANS5B裂解。我们既往构建了表达不同氨基端二级结构亚型HCV NS3/4A的多个点突变质粒， 发现某些亚型与其他亚型相比NS3 顺式丝氨酸蛋白酶活性较弱（另文发表）。本研究中， 我们拟构建NS3丝氨酸蛋白酶反式催化底物HCV NS5A5B表达质粒pSG5/NS5A5B△C， 为进一步研究不同二级结构亚型的NS3反式丝氨酸蛋白酶活性奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pTM1NS2NS5A5B△C质粒为本室构建［4］; Huh7细胞由本室保存。质粒抽提试剂盒购自Promega公司。DMEM培养基、 胎牛血清购自日水制药株式会社。FuGene 6 转染试剂盒购自Roche Diagnostics Corp。Antimouse IgGFITC购自Medical Biological Laboratories CO.， Ltd。鼠NS5A单克隆抗体(mAb)为Chemicon公司产品。引物由Invitrogen Corporation合成。限制性内切酶SacI， BglⅡ等试剂购自日本Toyobo公司。主要仪器: CO2培养箱（3141， IR Thermo Forma）; 荧光显微镜(BX51 TRF， Olympus)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 目的基因的扩增 以既往构建的pTM1NS2NS5A5B△C质粒为模板［4］， 使用PCR技术扩增NS5A5B△C片段。由于载体pTM1和pSG5中都含有SacⅠ酶切位点， 而5A5B△C片段中没有此酶切位点， 根据HCV NS5A5B△C序列设计扩增引物， 引入SacⅠ酶切位点(斜体)， 引物由InvitrogenTM Life Technology合成: 上游引物: GATCGAGCTCGCCATGTCCGGCTCGTGGCTCAG; 下游引物: GTTCGAGCTCCTATGCAGAGGCCTTCAAG。反应体系如下: 10×pfu DNA聚合酶Buffer 5 μL， 10 mmol/L dNTP 1 μL， 上游引物2.5 μL（10 pmol/μL）， 下游引物2.5 μL（10 pmol/μL）， 质粒模板DNA 1 μL（20 ng）， pfu DNA聚合酶 0.5 μL， 补水至50 μL。瞬时离心混匀， 放入PCR热循环仪， 按以下反应条件进行PCR反应: 94℃温育2 min， 94℃ 变性1 min， 50℃ 退火1 min， 72℃延伸5 min， 30个循环后， 再72℃延伸10 min。反应完毕后， 取1 μL PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。试剂盒纯化PCR产物。

　　1.2.2 酶切和连接 将NS5A5B△C和pSG5用SacⅠ限制性内切酶分别消化。酶切体系分别如下: NS5A5B△C 25 μL， 10×buffer 5 μL， SacⅠ3 μL， 补水至50 μL; pSG5 4 μL（0.7 g/L）， 10×buffer 5 μL， SacⅠ 3 μL， 补水至50 μL。分别于37℃反应3.5 h。反应完毕后， 各取1 μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。与预期吻合后， 酶切产物行琼脂糖凝胶电泳， 试剂盒（QIAEXⅡ Agarose Gel Extraction Kit）回收靶片段。保存于-20℃备用。对经过酶切的载体pSG5行脱磷酸化处理。然后对二者进行连接， 根据NS5A5B△C的大小， 确定二者比例为1∶5。连接体系: NS5A5B△C 8 μL， pSG5 1 μL， 2×Ligation Mix 9 μL， 置16℃反应15 min， 同时以去离子水代替NS5A5B△C片段， 设立阴性对照。

　　1.2.3 转化感受态细胞及克隆扩增 将连接产物转化大肠杆菌DH5 感受态细胞， 铺在有氨苄青霉素抗性的LB平板上， 37℃培养16 h。挑取单菌落， 扩大培养并提取质粒。质粒提取、 纯化均参照试剂盒说明进行。

　　1.2.4 重组质粒的酶切鉴定 用限制性内切酶SacⅠ和BglⅡ分别对提取的质粒做酶切鉴定。酶切体系如下: 质粒1 μL（1 μg）， SacⅠ1 μ L（10 U）， 10×Low Buffer 1.5 μL， 补水至15 μL; 质粒1 μL（1 μg）， BglⅡ1 μL（10 U）， 10×High Buffer 1.5 μL， 补水至15 μL， 37℃水浴进行酶切2 h。酶切产物在琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.2.5 Huh7细胞的培养和质粒转染 Huh7细胞于37℃， 50 mL/L CO2条件下用用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养， 细胞长满后传代， 之后每2 d传代1次。取传代4次以上的细胞， 按FuGene 6转染试剂操作步骤转染质粒。

　　1.2.6 免疫荧光检测HCV NS5A5B△C的表达 转染细胞孵育48 h后， 弃去培养液， PBS洗10 min×3次， 用40 g/L的多聚甲醛室温固定10 min， PBS洗10 min×3次， 1 mL/L 非离子型表面活性剂TritonX100透化处理10 min， PBS洗涤10 min×3次， 与鼠抗NS5A mAb室温孵育1 h， PBS洗涤10 min×3次， 与FITC标记的羊抗鼠IgG 避光室温孵育1 h， PBS洗涤10 min×3次， 封片， 荧光显微镜下观察。

　　1.2.7 Western blot检测HCV NS5A5B△C的表达 转染细胞孵育48 h后， 弃去培养液， PBS洗10 min×3次， 裂解细胞， 100℃热休克5 min， 行80 g/L的SDSPAGE电泳， 转膜。50 g/L脱脂奶粉37℃孵育1 h， 加入一抗（鼠抗NS5A mAb）， 37℃孵育1 h， PBS洗涤15 min×3次， 辣根过氧化酶标记的抗鼠二抗， 37℃孵育1 h， PBS洗涤15 min×3次， 增强发光显影。

　　2 结果

　　2.1 目的基因的扩增 以pTM1NS2NS5A5B△C为模板， 扩增出约2 244 bp的基因片段， 与HCV NS5A5B△C 大小一致（图1）。

　　图1 PCR扩增HCV NS5A5B△C基因（略）

　　Fig 1 PCR amplification of HCV NS5A5B△C gene

　　1: λ/HindⅢ DNA marker; 2: HCV NS5A5B△C.

　　2.2 重组质粒的酶切鉴定 转化的菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上， 连接产物平板上长出数十个菌落。阴性对照未见菌落生长。挑取单菌落， 扩大培养并提取质粒。经限制性内切酶SacⅠ和BglⅡ分别酶切鉴定后， 结果显示酶切片段大小和插入方向均与预计值一致。确定pSG5/NS5A5BΔC质粒构建成功（图2）。

　　图2 pSG5/NS5A5BΔC质粒的酶切鉴定（略）

　　Fig 2 Identification of pSG5/NS5A5BΔC by endoenzyme digestion

　　1: pSG5/NS5A5B△C/Sac I; 2: pSG5/NS5A5B△C; 3， 4: λ/Hind Ⅲ DNA marker; 5: φ×174/Hae Ⅲ DNA marker; 6: pSG5/NS5A5B△C/Bgl Ⅱ.

　　2.3 pSG5/NS5A5BΔC质粒在Huh7细胞中的表达 转染48 h后， 荧光显微镜下可见Huh7细胞表达带有绿色荧光的HCV NS5A5B△C蛋白， 该蛋白主要表达于细胞质， 呈强绿色荧光， 表达率达40%以上（图3）。Western blot结果显示在正常Huh7细胞中， 未出现大小约Mr 82 000的条带， 而在转染pSG5/NS5A5B△C的Huh7细胞中， 出现了大小约Mr 82 000的条带(图4)。说明构建的pSG5/NS5A5B△C可在Huh7细胞中瞬时表达。

　　图3 荧光显微镜下HCV NS5A5B△C在Huh7中的表达（略）

　　Fig 3 Expression of HCV NS5A5B△C in Huh7 cells under fluorescent microscope (FITC， ×100)

　　图4 Western blot检测HCV NS5A5B△C在Huh7中的表达（略）

　　Fig 4 Expression of HCV NS5A5B△C in Huh7 cells detected by Western blot

　　1: pSG5/NS5A5B△C transfected Huh7 cells; 2: Blank Huh7cells; 3: Protein marker.

　　3 讨论
　　
　　全球范围内有3%的人口感染HCV， 据估计， 感染者中只有1/5的人体内可以产生免疫应答从而清除HCV感染［5］。慢性HCV感染会导致退行性肝脏疾病， 最终发展成肝硬化或者肝细胞癌， 这已成为世界性的重大健康问题。HCV可以成功逃避宿主的免疫应答， 这在一定程度上是由于HCV 可以成功拮抗Ⅰ型干扰素（Type Ⅰ IFNs）的产生和信号传导。Type Ⅰ IFNs， 包括IFNα和IFNβ， 是宿主抵抗病毒入侵的前沿阵地。HCV NS3/4A在抑制Type Ⅰ IFNs产生从而干扰HCV慢性感染过程中发挥着重要作用。NS3含有丝氨酸蛋白酶和RNA解螺旋酶活性， 但其活性的发挥需要其辅助因子NS4A的协同作用。NS3/4A 蛋白酶不但是产生病毒复制所需要的成熟病毒蛋白所必须的， 更重要的， 它还通过切割细胞内与IFNα和IFNβ诱导作用有关的靶分子从而抑制宿主的抗病毒免疫系统［6］。
　　
　　人群中NS3氮末端的序列变异性很大， 从而导致了不同的NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性， 即HCV不同的免疫性。但HCV1b亚型通常IFN治疗效果较差， 病程急， 而且肝细胞癌发生率较高［7， 8］。以前曾报道过HCV NS3氮末端的120个氨基酸残基的二级结构与HCV感染患者发生肝细胞癌的危险性具有相关性， 表明NS3的氮末端对于HCV致病性具有重要作用， 比如抗凋亡性、 培养细胞的恶性转化、 及肝细胞癌的发生发展等［9］。另有研究表明， HCV NS3可与肿瘤抑制因子p53结合， 从而抑制p53的功能。不同序列的NS3与p53的结合能力亦有差异， 二者结合能力强， 则抑制能力强， 结合能力弱， 则抑制能力弱［10］。我们曾针对HCV NS3氨基端120个氨基酸残基的二级结构， 以pSG5为载体， 构建了表达氨基端不同二级结构的HCV NS3/4A的多个点突变质粒pSG5/NS34A， 并发现各个亚型间顺式NS3丝氨酸蛋白酶活性存在差异［另文报道］。
　　
　　为了进一步研究各个亚型间反式丝氨酸蛋白酶活性是否存在差异， 我们需要同样以pSG5为载体， 构建表达其作用底物的质粒， 并将其与以前构建的各个亚型pSG5/NS34A质粒共同转染Huh7细胞， 以进一步研究不同二级结构亚型的NS3反式丝氨酸蛋白酶活性奠定基础。本研究中， 我们以本室既往构建的pTM1/NS2NS5A5B△C质粒为模板［4］， 使用PCR技术扩增NS5A5B△C片段。由于载体pTM1和pSG5中都含有SacⅠ酶切位点， 而HCV 5A5B△C片段中没有此酶切位点， 我们根据HCV NS5A5B△C序列设计扩增引物， 并引入SacⅠ酶切位点， 以确保能从pTM1/NS2NS5A5B△C质粒上完整切下5A5B△C片段。在选择酶切鉴定的内切酶时， 可以利用引物中引入的SacⅠ酶切位点， 用SacⅠ鉴定是否可以从构建体中切下预期的HCV 5A5B△C片段。但SacⅠ只能鉴定HCV 5A5B△C片段是否插入pSG5载体中， 而无法确认插入的方向是否正确。由于pSG5载体和HCV 5A5B△C片段中都含有BglⅡ酶切位点， 如果HCV 5A5B△C片段按照正确的方向插入pSG5载体， 则BglⅡ可以切出大小分别约为5.7 kb和610 bp的两个片段， 而如果反方向插入pSG5载体， 切出的片段大小则分别约为4.7 kb和1.6 kb。所以我们选择分别用SacⅠ和BglⅡ单独酶切构建体鉴定插入片段的大小和方向， 结果与预期一致。
　　
　　我们通过分子生物学技术成功构建的pSG5/NS5A5B△C 表达质粒， 与预期结果相一致， 能够成功表达HCV NS5A5B△C蛋白。它能够为研究HCV1b各二级结构亚型间NS3丝氨酸蛋白酶的活性提供物质基础， 为进一步研究不同二级结构HCV拮抗IFN的作用差异提供前期条件和研究基础。

　　致谢: 本课题受日中笹川医学研究者制度资助。感谢日本神户大学医学部研究科微生物学分野全体工作人员的无私帮助和热情指导。

参考文献

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