甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞转分化和TGFβ1表达的影响

【摘要】 　　目的: 通过观察甲状旁腺素（PTH）对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子β1（TGFβ1）表达的影响， 以探讨PTH在肾间质纤维化发病机制中的作用。方法: 体外培养人近端肾小管上皮细胞（HK2）， 分别用不同浓度的PTH（10-12、 10-11、 10-10、 10-9、 10-8 mol/L）作用于HK2细胞48 h， 以及10-8 mol/L PTH作用于HK2细胞不同时间（12、 24、 48、 72 h）。应用RTPCR法检测HK2细胞内αSMA、 TGFβ1 mRNA表达水平， 免疫细胞化学法检测HK2细胞表达αSMA阳性细胞百分数， Western blot法检测细胞内αSMA的蛋白表达水平。结果: (1)RTPCR结果表明， PTH 呈剂量和时间依赖性地促进HK2细胞αSMA、 TGFβ1 mRNA的表达（P＜0.01）， 且两者之间呈正相关（P＜0.05）。(2)免疫细胞化学结果表明， PTH可增加表达αSMA阳性的HK2细胞百分数， 且呈剂量和时间依赖性（P＜0.05）。(3)Western blot结果表明， PTH可增加HK2细胞αSMA的蛋白表达量， 也呈剂量和时间依赖性（P＜0.01）。结论: PTH可通过促进肾小管上皮细胞转分化以及TGFβ1的表达促进肾小管间质纤维化。

【关键词】 甲状旁腺素; 肾小管上皮细胞; 转分化; 转化生长因子β1

　　肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis， RIF）是各种肾脏疾病进展为终末期肾病的共同途径［1］。而肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化（tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation， TEMT）被认为是发生RIF的重要机制之一［2］。最近报道， 有些尿毒症毒素可造成RIF， 如糖基化终末产物、 硫酸吲哚酚、 瘦素等［3-5］。甲状旁腺素（parathyroid hormone， PTH）作为尿毒症毒素之一， 是否在RIF的发病机制中起着重要作用， 目前尚未见报道。本实验利用体外培养的人近端肾小管上皮细胞， 研究PTH对其转分化以及转化生长因子β1（TGFβ1）表达的影响， 以探讨PTH在RIF发病机制中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人近端肾小管上皮细胞（HK2细胞株）购自中国协和医科大学细胞中心（来源于美国ATCC公司）。PTH1-34购自Sigma公司， TRIzol购自Invitriogen公司， 逆转录试剂盒购自Promega公司， α平滑肌肌动蛋白（αSMA）小鼠抗人单克隆抗体(mAb)、 辣根酶标记兔抗小鼠二抗及SP法免疫组化试剂盒购自北京中杉公司， αSMA、 Tubulin小鼠抗人mAb及碱磷酶标记兔抗小鼠二抗购自Santa Cruze公司。DMEM/F12培养基购自Gibco公司， 胎牛血清（FCS）购自天津血研所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人近端肾小管上皮细胞的培养及药物干预 HK2细胞培养于含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液中， 试验前应用无血清培养液同步化24 h， 分别加入终浓度为10-12、 10-11、 10-10、 10-9、 10-8 mol/L PTH的含50 mL/L FCS 的DMEM/F12 培养液刺激HK2细胞48 h， 以及10-8 mol/L PTH刺激HK2细胞不同时间（12、 24、 48、 72 h）， 收集细胞进行实验。每组实验均重复3次。

　　1.2.2 RTPCR法检测PTH对HK2细胞αSMA和TGFβ1 mRNA表达的影响 细胞总RNA提取按TRIzol试剂说明书操作。应用Promega公司提供的Reverse Transcription System试剂盒进行cDNA第1链的合成， 反应总体积为20 μL。应用Primer Premier5软件设计引物: αSMA (445 bp): 上游5′GAA GCA CAG AGC AAA AGA GG3′; 下游5′CAG CAG TaG TAA CGA AGG AAT AG3′。TGFβ1 (306 bp): 上游5′AGG TCA CCC GCG TGC TAA T3′; 下游5′TCA ACC ACT GCC GCA CAA CT3′。βactin (202 bp): 上游 5′CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G3′; 下游 5′GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC3′。以上引物由上海生工公司合成。扩增αSMA 基因的PCR反应条件为: 先于94℃变性5 min， 然后于94℃ 45 s， 58℃ 45 s， 72℃ 1 min， 共30个循环后， 再于72℃延伸7 min。扩增TGFβ1 基因的PCR反应条件为: 先于94℃变性5 min， 然后于94℃ 30 s， 58℃ 30 s， 72℃ 45 s， 共28个循环后， 再于72℃延伸7 min。分别取6 μL PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳， 凝胶在凝胶成像系统（BioRad）中扫描观察结果， 分析电泳条带灰度。

　　1.2.3 免疫细胞化学法检测PTH对HK2细胞αSMA表达的影响 采用SP法， 收集细胞爬片， 40 g/L多聚甲醛液固定， 30 mL/L h3O2处理， 抗原修复， 封闭， 加入小鼠抗人αSMA一抗， 4℃过夜， 滴加二抗， 37℃孵育10 min， 滴加辣根酶标记链酶卵白素， 37℃孵育10 min， DAB显色， 苏木素复染。应用PBS代替一抗做阴性对照。

　　1.2.4 Western blot法检测HK2细胞αSMA的蛋白表达水平 消化收集细胞， 用预冷的PBS洗2遍， 加入预冷的细胞裂解液冰上裂解30 min提取总蛋白， 100℃煮沸5 min， SDSPAGE电泳（浓缩胶100 v， 分离胶150 v）， 转移电泳(湿式转移， 200 mA， 120 min)， 50 g/L脱脂奶粉封闭1 h， 加入小鼠抗人αSMA mAb（1∶200）或Tubulin mAb（1∶500）， 室温孵育1 h， 洗膜后加入兔抗小鼠二抗（1∶1 000）， 室温孵育50 min， 洗膜， BCIP/NBP法显影， 观察结果、 扫描、 分析。

　　1.2.5 统计学分析 实验数据用x±s表示， 用SAS8.1统计软件进行单因素方差分析（OneWay ANOVA）， 多个样本均数间每两个均数的比较选择SNK法（q检验）。两变量的相关关系采用直线相关分析。

　　2 结果

　　2.1 PTH对HK2细胞αSMA、 TGFβ1 mRNA表达水平的影响 RTPCR结果显示， 正常HK2细胞几乎不表达αSMA， 少量表达TGFβ1。随着PTH浓度的升高和刺激时间的延长， αSMA、 TGFβ1的mRNA表达量逐渐增多， 与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01， 图1、 2）。且αSMA与TGFβ1表达之间呈正相关（浓度效应相关系数r为0.565， P＜0.05， 时间效应相关系数r为0.726， P＜0.01）。

　　图1 不同剂量的PTH对HK2细胞αSMA和TGFβ1 mRNA表达的影响（略）

　　M: DNA marker; 1: 对照; 2-6: PTH (10-12， 10-11， 10-10， 10-9， 10-8 mol/L).

　　图2 PTH作用不同时间对HK2细胞αSMA和TGFβ1 mRNA表达的影响（略）

　　M: DNA marker; 1: 对照; 2-5: PTH (12， 24， 48， 72 h).

　　2.2 PTH对HK2细胞表达αSMA的影响 免疫细胞化学结果表明， 正常HK2细胞不表达αSMA， 10-12 mol/L PTH刺激HK2细胞12 h即可见少数细胞表达αSMA， 48 h达到高峰， 随着PTH浓度的升高， αSMA阳性的HK2细胞百分数逐渐增多（图3）。

　　2.3 PTH对HK2细胞αSMA蛋白表达水平的影响 Western blot结果表明， 正常HK2细胞不表达αSMA， PTH呈剂量和时间依赖性地增加HK2细胞αSMA的蛋白表达量（P＜0.01， 图4、 5）。

　　图3 PTH作用于对HK2细胞48 h对αSMA表达阳性率的影响 (SP， ×200)（略）

　　A: 对照; B-F: PTH (10-12， 10-11， 10-10， 10-9， 10-8 mol/L).

　　图4 不同剂量的PTH对HK2细胞αSMA蛋白表达的影响（略）

　　1: 对照; 2-6: PTH (10-12， 10-11， 10-10， 10-9， 10-8 mol/L).

　　图5 PTH作用不同时间对HK2细胞αSMA蛋白表达的影响（略）

　　1: 对照; 2-5: PTH (12， 24， 48， 72 h).

　　3 讨论
　　
　　近年来研究发现， 在慢性肾脏病早期， 多数患者的血清PTH水平即已显著升高［6］。过度升高的血清PTH不仅影响骨质代谢， 导致严重的肾性骨病， 而且对心血管系统、 神经系统、 免疫系统和红细胞生成等均产生负性影响。PTH成为一种新型的尿毒症毒素已为学者们所共识。RIF是一种慢性进行性病理改变， 在慢性肾脏病转归中起重要作用。肾小管上皮细胞通过转分化为肌成纤维细胞、 分泌细胞因子， 促进细胞外基质的合成等参与RIF的进展。目前公认肾小管上皮细胞表达αSMA是其向肌成纤维细胞转分化的标志［7］。
　　
　　本实验从基因和蛋白水平， 检测不同浓度PTH对HK2细胞αSMA表达的影响。结果表明， PTH呈剂量与时间依赖性地增加HK2细胞αSMA mRNA和蛋白的表达水平， 以及αSMA阳性细胞百分数。从而说明PTH可通过促进肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞， 促进RIF的进展。
　　
　　TGFβ1是一种多功能的细胞因子， 与肾间质纤维化关系密切， 被认为是诱导上皮细胞转分化的最重要的细胞因子［8］。本实验中应用RTPCR法检测PTH对HK2细胞TGFβ1 mRNA表达的影响， 结果提示PTH呈剂量和时间依赖地促进性HK2细胞TGFβ1 mRNA的表达。且其表达水平与αSMA mRNA表达水平呈正相关。说明PTH可通过促进HK2细胞TGFβ1的产生促进RIF。在PTH促进肾小管上皮细胞转分化的过程中， 内源性的TGFβ1可能发挥了重要作用。
　　
　　总之， PTH可通过促进肾小管上皮细胞转分化及TGFβ1的表达促进RIF， 拮抗PTH的作用可能成为防治RIF的新靶点。

参考文献

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　　［8］ 李晓东， 陈孝文， 唐德燊， 等. 醛固酮对肾小球系膜细胞合成分泌纤维连接蛋白和TGFβ1表达的影响［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(2): 140-147.