IL11保护中子照射后肠上皮损伤的Jak/STAT信号转导机制研究

　　　　作者：王瑞娟， 彭瑞云， 高亚兵， 常公民， 徐新萍， 付凯飞， 罗庆良

【摘要】 　　目的: 探讨IL11对中子照射后肠上皮内Jak/STAT通路的影响， 并观察其对Bax和Bcl2表达的影响。方法: BALB/c小鼠和IEC6细胞经4 Gy中子照射和IL11处理分别作为肠上皮损伤的体内外模型， 采用HE染色、 Western blot、 EMSA、 免疫组化和图像分析技术分别检测肠道病理变化、 Jak1和STAT3活性及Bax和Bcl2的表达。结果: (1)中子照射后， 小鼠肠道损伤极为严重， 且未见明显再生; IL11治疗组隐窝上皮细胞及存活隐窝数量较多。(2)中子照射后， IEC6细胞Jak1和STAT3活性均减弱， IL11处理可增加二者活性。(3)中子照射后， 小鼠肠道Bax表达增加， Bcl2表达无明显改变; 应用IL11可降低Bax表达， 增加Bcl2表达。结论: 在中子辐射时， IL11可通过激活Jak/STAT通路， 并下调Bax表达， 上调Bcl2表达， 对肠上皮起到一定的保护作用。

【关键词】 放射; 肠上皮; IL11; Jak/STAT; 凋亡

　　［Abstract］ AIM: To explore the effect of IL11 on the activation of Jak/STAT pathway and the expressions of Bax and Bcl2 in the intestinal epithelial cells exposed to neutron radiation. METHODS: The BALB/c mice and IEC6， irradiated by 4 Gy neutron with or without IL11 treatment， served as in vivo and in vitro model seperately. The changes of the intestines， activity of Jak1 and STAT3 and expressions of Bax and Bcl2 were observed by HE staining， Western blot， EMSA， immunohistochemistry and image analysis. RESULTS: (1)Mice exposed to neutron radiation showed severe intestinal damages and no obvious regeneration was seen. IL11treated mice had a larger number of cryptal epithelial cells and crypts. (2)Neutron radiation decreased the activities of Jak1 and STAT3， while IL11 increased their activities. (3) Neutron radiation decreased the expression of Bax and didn’t change the level of Bcl2 in the murine intestine. IL11 administration decreased the expression of Bax and increased that of Bcl2. CONCLUSION: The mechanism of the intestinal protection of IL11 in neutron irradiation might be that IL11 stimulation triggered activation of Jak/STAT pathway， downregulated the expression of Bax and upregulated the expression of Bcl2.

　　［Keywords］radiation; intestinal epithelium; interleukin11; Jak/STAT; apoptosis

　　肠上皮对细胞毒性事件尤其是中子辐射高度敏感， 目前尚无防治良策。白细胞介素11（interleukin11， IL11）是一种多效能的细胞因子， 有研究显示其在一些肠道损伤模型中可保护肠隐窝干细胞［1， 2］。本课题组前期研究结果表明， IL11可刺激肠上皮细胞表面IL11受体表达上调， 抑制中子辐射后肠上皮细胞凋亡， 促进增殖［3］。但有关IL11诱导的Jak/STAT通路在其中的改变及意义如何， 迄今未见报道。肠道放射损伤时， 细胞凋亡是其损伤的主要反应之一， Bcl2和Bax是细胞凋亡的重要调控分子， 同时也受到信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription3， STAT3）的调控［1， 4］。为此， 本研究复制了IL11保护中子照射肠上皮损伤的体内外模型， 并探讨了Jak/STAT通路及Bcl2、 Bax在其中的变化及意义， 以期为其防治提供依据和线索。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 大鼠空肠上皮细胞系（intestinal epithelium cell line No.6， IEC6）由本所罗庆良研究员惠赠。IL11粉剂购于杭州九源基因公司。兔抗磷酸化Jak1为Cell Signaling Technology公司产品。HRP标记的山羊抗兔IgG、 兔抗βactin、 兔抗Bax及兔抗Bcl2为Santa Cruz公司产品。BCA蛋白浓度测定试剂盒和Western发光底物试剂盒为Pierce公司产品。预染蛋白标志物为New England Biolab产品。凝胶迁移分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）试剂盒为Promega公司产品， STAT3特异结合序列由上海生工合成， ［γ32P］ATP购自北京福瑞生物公司。SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及IL11处理 细胞分为正常对照组（Control）、 中子照射组（N）、 照前IL11预处理组（B11）和照射后IL11处理组（A11）。IEC6细胞接种在含100 mL/L胎牛血清的高糖型DMEM培养液中， 贴壁后将血清浓度降至25 mL/L继续培养24 h， 随后在照前IL11预处理组细胞培养液中加入100 μg/L的 IL11， IL11预处理12 h后照射。照射后IL11处理组于照射后即刻加入IL11。

　　1.2.2 动物分组及IL11治疗 94只雄性BALB/c小鼠（18～22 g）随机分为正常对照组（24只）、 照射组（40只）和IL11治疗组（30只）。IL11治疗组于照射后即刻给予600 μg/kg的IL11， 1次/d， 连用3 d。

　　1.2.3 中子照射方法 中子（其中混有10%的γ射线）照射剂量率39.69 cGy/min， 平均能量5.0 MeV， 吸收剂量为4 Gy。

　　1.2.4 动物活杀及肠道病理检查 于照射后6 h、 1 d、 2 d和3 d活杀照射和正常组动物， IL11治疗组照射后3 d开始活杀。取空肠固定于40 g/L甲醛（以PBS稀释）中， 石蜡包埋， 切片， HE染色观察病理形态改变。

　　1.2.5 Jak1激酶磷酸化活化的Western blot检测 分别于照射后5、 10、 15和30 min收集细胞， 加入裂解液冰浴40 min， 12 000 r/min离心15 min， 收集上清即为细胞总蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后， 将蛋白进行SDSPAGE电泳分离， 并转移至硝酸纤维素膜上， 预染蛋白标志物指示条带位置。蛋白Western blot的一抗分别为兔抗磷酸化的Jak1（1∶1 000）和兔抗βactin（1∶1 000）， 二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000）。蛋白条带应用ECL发光试剂盒显影。设βactin作为内参照。

　　1.2.6 STAT3转录因子活性的EMSA分析 按照试剂盒说明进行。STAT3寡核苷酸序列为5′GATCCTTCTGGGAATTCCTAGATC3′， T4多聚核酸酶将γ32P标记在双链寡核苷酸上， 每个反应体系中加入1 μL标记的寡核苷酸探针。将反应复合物加在40 mL/L甘油凝胶电泳分离， 之后压片， -70℃曝光12 h后显影。实验同时设置对照， 对其序列结合进行特异性检验。

　　1.2.7 小鼠肠道Bax和Bcl2表达的免疫组织化学检测 切片脱蜡后经30 mL/L过氧化氢灭活内源性过氧化物酶， 微波抗原修复， 山羊血清封闭。Bax、 Bcl2一抗工作液浓度为1∶100， 生物素标记的山羊抗兔IgG及HRP标记链亲和素均为1∶200， DAB显色， 苏木素复染细胞核。PBS代替一抗作阴性对照。阳性结果呈棕黄色。

　　1.2.8 图像分析及统计学处理 对免疫组织化学和Western blot结果， 应用CMIASⅡ图像分析仪分别进行平均光密度（mean optical density， MOD）测定和定量分析。数据以x±s表示， 经SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析， Excel软件作图。P&<0.05表示有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 IL11对中子辐射小鼠肠道损伤的影响 从肠道宏观改变看， 4.0 Gy照射组及IL11治疗组动物无明显差别， 均表现为: 肠道呈黄色， 肠壁菲薄可透光， 黏膜皱襞消失， 肠腔大量渗出液， 肠壁淋巴结难以寻见， 全肠长度明显缩短; 但在照射后2 d时， 中子照射组和IL11治疗组腹泻发生率分别为53.3%（16/30）和43.3%（13/30）， 显示IL11治疗有降低其腹泻发生率的趋势。镜下见4.0 Gy中子照射后3 d内， 肠道尤其空肠损伤进行性加重， 镜下可见肠黏膜大面积坏死脱落， 绒毛上皮细胞数量减少、 排列紊乱， 隐窝细胞数量急剧减少等（图1A）; IL11治疗组隐窝上皮细胞较丰富， 存活隐窝数量多（图1B）， 表明IL11对肠上皮细胞具有一定保护作用。

　　图1 中子照射后3 d小鼠空肠病理检查（略）

　　Fig 1 Histological changes of the murine small intestine at 3 d after neutron irradiation

　　A: 3 d after neutron irradiation(×200); B: 3 d after neutron irradiation and IL11 administration(×400).

　　2.2 IEC6细胞中磷酸化Jak1表达的改变 Western blot结果显示， 正常IEC6细胞中， Jak1具有弱磷酸化水平， 照射后5 min， 其活性几乎消失， 而照前和照后应用IL11组， 无明显下降， 且与照射后10和15 min， 磷酸化水平升高， 于10 min达高峰， 30 min时其活性下降。应用IL11组其5 min时活性强于照射组（图2）。表明中子照射可引起IEC6细胞Jak1激酶磷酸化活化减弱， IL11处理可刺激Jak1激酶磷酸化活化。

　　图2 IL11对4.0 Gy中子辐射IEC6细胞Jak1活性的影响（略）

　　Fig 2 Effect of IL11 on the Jak1 tyrosine phosphorylation in IEC6 after 4.0 Gy neutron irradiation with (＋) or without (-) IL11 treatment

　　aP&<0.05 vs control group; cP&<0.05 vs neutron group.

　　2.3 IEC6细胞中STAT3转录因子活性的变化 正常IEC6细胞中存在活化的STAT3， 形成强阻滞条带， 中子照射后30 min， 其阻滞条带变化不明显， 照射后1 h， 其活性明显减弱， 基本上无阻滞形成。在照射后施加IL11， 于15 min和30 min均可形成强阻滞， 且其活化可维持至照射后1 h（图3）。这表明， 在中子辐射IEC6细胞损伤时， IL11刺激可引起STAT3活化。

　　图3 EMSA法检测IL11对中子辐射后IEC6细胞核提取物中STAT3活化的影响（略）

　　Fig 3 EMSA analysis for STAT3 activation using nuclear extracts of IEC6 after neutron irradiation with (＋) or without (-) IL11 treatment

　　A: Analysis of sequencespecific DNAbinding of STAT3; 1: Negative control; 2: Positive control; 3: Specific competitor reaction; 4: Nonspecific competitor reaction. B: Effect of IL11 on STAT3 activation in IEC6 after neutron irradiation.

　　2.4 IL11对小鼠空肠Bax表达的影响 Bax于正常肠绒毛及隐窝上皮细胞呈弱阳性表达， 中子照射后6 h～3 d， Bax表达持续增加， 3 d时呈强阳性， 阳性部位见于肠绒毛及隐窝上皮细胞质， 以绒毛为著。IL11治疗组在照射后3 d时， Bax表达呈阳性， 强度弱于照射组。定量分析结果见表1。表明IL11可下调中子辐射后肠上皮细胞Bax的表达。

　　2.5 IL11对小鼠空肠Bcl2表达的影响 Bcl2于正常肠绒毛及隐窝上皮细胞质呈微弱阳性表达， 中子照射后6 h～3 d， Bcl2表达无明显改变。IL11治疗3 d后， Bcl2表达明显增加。定量分析结果见表2。表明IL11可增加中子辐射后肠上皮细胞Bcl2的表达。

　　表1 IL11对中子照射后小鼠空肠Bax表达的影响（略）

　　Tab 1 Effect of IL11 on the expression of Bax in the murine small intestine after neutron irradiation（MOD×10-1)

　　aP&<0.05 vs control group; cP&<0.05 vs neutron group. … means no datum.

　　表2 IL11对中子照射后小鼠空肠Bcl2表达的影响（略）

　　Tab 2 Effect of IL11 on the expression of Bcl2 in the murine small intestine after neutron irradiation（MOD×10-1)

　　aP&<0.05 vs control group; cP&<0.05 vs neutron group. … means no datum.

　　3 讨论
　　
　　放射性肠道损伤尤其是中子辐射所致的肠道损伤的防治， 目前仍然是困扰世界的难题。究其原因， 主要是因为其致伤的机制尚未完全阐明。本课题组尝试应用IL11于中子辐射肠上皮损伤的防治， 发现IL11可抑制凋亡， 并促进损伤后细胞增殖［3］。但IL11发挥防护作用的机制如何， 目前尚不明确。IL11通过与其受体结合后， 在细胞内诱导的参与细胞增殖与损伤修复的主要信号通路之一为Jak/STAT信号通路［1］。本研究中， 我们发现中子辐射后， 肠上皮内Jak/STAT信号通路活化受到抑制， 而IL11则可激活该通路。有关Jak/STAT通路在肠道中的病理生理意义， 既往通过一些基因突变动物模型的研究发现［5， 6］， IL11受体基因敲入突变删除全部STAT结合位点的小鼠会自发地患上肠溃疡， 且上皮损伤修复能力减弱， 应用DSS（磺琥辛酯钠）诱导急性肠上皮损伤时， 与野生型小鼠比较， 基因突变小鼠的肠道病变更复杂、 肠上皮腐蚀程度更重且存活率低。而转录因子 STAT3下游许多靶基因都与细胞的增殖和凋亡密切相关， 其中Bcl2和BclxL也受到STAT3调控， 因此STAT3在调节肠上皮细胞增殖、 损伤后存活、 凋亡及炎症反应在内的多种过程中具有重要作用［7， 8］。
　　
　　STAT3下游的Bcl2是细胞凋亡调控的重要分子， 可通过控制细胞核内外物质的运输和抑制Ca2+的释放或阻断细胞内过氧化物的堆积而发挥抗凋亡作用。而Bax作为Bcl2的同源体， 其作用是抑制Bcl2作用。Bax与Bcl2在细胞中的比例决定细胞是否发生凋亡。Bax过量时， 形成BaxBax 同二聚体， 诱导细胞凋亡; Bcl2过量时， 形成Bcl2Bax异二聚体， 抑制细胞凋亡［4］。我们的研究也发现， IL11诱导Jak/STAT通路活化后， 对其下游凋亡靶蛋白Bcl2和Bax也有影响， IL11可通过上调Bcl2的表达并抑制Bax的表达水平， 从而发挥肠道保护作用。
　　
　　总之， IL11诱导的Jak/STAT信号通路在调节肠道病理生理过程中十分重要。但其在放射性肠道损伤中的变化及意义目前尚未见报道。本研究结果表明中子辐射后， 肠上皮Jak/STAT通路活化受到抑制， Bax表达过量， 诱导肠上皮细胞发生凋亡; 而IL11则可通过激活Jak/STAT通路， 上调Bcl2同时下调Bax的表达， 起到一定的抗凋亡作用， 并有助于肠隐窝再生， 从而对肠上皮细胞起到放射保护作用。本研究为IL11应用于临床放射病人的治疗提供了新的依据， 也为放射性肠道损伤的防治提供了一条新的思路。

参考文献

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