甲氧滴滴涕对小鼠子宫内膜胰岛素样生长因子1表达的调节作用

　　　　 作者：周建兴， 马向东， 马佳佳， 王德堂， 陈必良

【摘要】 　　目的: 探讨甲氧滴滴涕（MXC）对小鼠子宫内膜胰岛素样生长因子1（IGF1)表达的影响。方法: 将出生后7～8周的成熟雌性小鼠随机分为4组， 每只分别给予玉米油、 甲氧滴滴涕（MXC）50、 100、 200 mg/kg灌胃， 1次/d， 共30 d， 之后24 h内， 取小鼠子宫用免疫组化SABC法检测IGF1蛋白的表达水平; 采用反转录多聚酶链式反应（RTPCR MXC）的方法检测IGF1 mRNA的表达水平。结果: 与对照组比较， 100、 200 mg/kg MXC两组的IGF1蛋白表达增加有统计学意义（P&<0.05）; 两组IGF1 mRNA表达增加有统计学意义（P&<0.05）。结论: 长期MXC染毒可增加IGF1在小鼠子宫内膜的表达。

【关键词】 甲氧滴滴涕; 子宫内膜; 胰岛素样生长因子1

　　甲氧滴滴涕（methoxychlor， MXC）是一种替代滴滴涕的有机氯杀虫剂， 其杀虫效果明显， 生物毒性相对较低， 因而在许多国家得到广泛应用。体内外研究表明， MXC在体内具有雌激素活性， 大量的研究表明其模仿雌二醇(E2)在啮齿类动物生殖系统中起作用。在去除卵巢的动物中引起亲子宫反应， 在孕期慢性暴露于MXC的啮齿类动物可以产生发育和生殖毒性， 包括胚胎毒性、 性早熟、 生育力减弱［1］。Goldman等［2］研究了MXC暴露后小鼠子宫蛋白合成能力变化， 结果MXC暴露后小鼠子宫重量增加， 细胞肥大， 蛋白合成增加， 这些数据显示甲氧滴滴涕暴露可改变小鼠子宫细胞基因表达。William等［3］将小鼠经4周的MXC染毒后子宫内膜间质疏松， 血管丰富， 腺体丰富， 腺腔较大， 子宫内膜厚度增加有统计学意义(P&<0.05)。然而国内外研究报道长期慢性染毒MXC对雌性育龄小鼠子宫内膜生长因子影响的研究报道较少。本实验我们采用MXC给雌性育龄小鼠染毒， 观察其子宫， 旨在探讨MXC对雌性小鼠生殖毒性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　SPF级昆明种纯系雌性小鼠40只， 鼠龄7～8周， 体质量（28±5）g， 由第四军医大学实验动物中心提供， 自由采食， 饮水， 室温20～22℃， 昼夜交替为14/10 h。MXC标准品(纯度99%)购自美国Sigma公司。逆转录试剂盒为TaKaRa公司产品。兔抗鼠IGF1抗体和免疫组织化学试剂盒均购自武汉博士德生物公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组染毒

　　小鼠经适应性饲养1周， 随机分为溶剂对照组（芝麻油）和MXC 50、100、200 mg/（kg·d）3个染毒组， 每组10只。小鼠每日8∶00～10∶00灌胃染毒， 连续染毒30 d后立即切除子宫备用。

　　1.2.2 子宫组织总RNA的提取和RTPCR反应及结果分析

　　用氯仿异丙醇抽提法提取细胞RNA。使用MBI公司的cDNA第1链合成试剂盒逆转录mRNA。以合成好的cDNA做为模板， PCR扩增IGF1。引物: 北京奥科生物技术有限公司合成。采用半定量逆转录聚合酶链反应技术（RTPCR法）， 用内对照吸光度值标化IGF1吸光度值， 得到其相对含量， 具体计算公式: IGF1mRNA相对含量=(IGF1密度/βactin密度)×100。

　　1.2.3 免疫组织化学染色

　　厚度4μm， 经脱蜡、水化、微波抗原修复、标准免疫化学操作程序， DAB显色。应用两步法， 按兔抗鼠IGF1抗体和免疫组织化学试剂盒的说明书操作。无染色为（-）; 淡黄色为（+）; 黄色为（++）; 深棕色为（+++）。同时行免疫荧光对照， 在一抗后， 分别直接避光添加1∶200羊抗小鼠IgG， 1∶30 FITC标记羊抗鼠IgG， 37℃孵育30 min后， 避光PBS冲洗， 荧光显微镜下观察。

　　1.2.4 染色强度定量测量

　　测定阳性染色的光密度值， 每张切片随机选择5～6个高倍视野， 以每张切片染色背景作对照， 测量每个细胞的染色强度(optical density， OD)， 用以计算每张切片的染色强度， 计算每张切片的平均表达量， 用以表示IGF1相对含量。

　　1.2.5 统计学分析

　　结果用 SPSS16.0统计分析软件分析， 采用单因素方差分析， 选用LSDt检验进行各组与对照组之间的两两比较， 实验组之间的两两比较选用SNKq检验， 检验水准取α=0.05。

　　2 结果

　　免疫荧光显示IGF1主要在子宫内膜的腺上皮细胞和间质细胞的胞质及胞膜上阳性表达， 偶可血管内皮细胞见到其蛋白表达（图1）。免疫组织化学染色强度定量显示: 4组小鼠子宫内膜均有IGF1表达， MXC 100、 200 mg/（kg·d）2个染毒组的子宫内膜、 腺体及间质部的IGF1蛋白表达量明显高于对照组， 有统计学意义（P&<0.05， 图2）; 同时MXC 100、200 mg/（kg·d）2个染毒组的IGF1mRNA表达明显高于对照组， 有统计学意义（P&<0.05， 图3）。MXC 50 mg/（kg·d）IGF1mRNA表达及免疫组织化学染色强度定量与对照组比较， 无统计学意义（P&>0.05， 表1）。表1 各组小鼠子宫内膜IGF1表达及mRNA的表达(略)

　　3 讨论

　　我国作为一个农业大国， 农药年产量80万吨， 其中农药MXC作为滴滴涕的替代物应用广泛， 产量近20万吨， 国外研究表明在土壤、河流海洋、动植物体内和人体血清、脂肪、肝脏组织中已检测到了MXC［4］。多项研究表明此类物质进入人和动物体内模拟细胞内雌激素作用或改变雌激素活性， 通过多种机制表现出拟天然雌激素的作用， 导致生育功能障碍、生长发育异常、出生缺陷、代谢紊乱及生殖系肿瘤等， 尤其对子宫内膜的影响受到各个国家科研人员的广泛关注。本研究显示IGF1主要分布在子宫内膜的腺上皮细胞和间质细胞， 4组小鼠子宫均有表达， MXC 100、 200 mg/（kg·d）2个染毒组的IGF1基因蛋白表达明显高于对照组， 有统计学意义， 这说明MXC长期染毒后对小鼠子宫可造成IGF1基因转录水平上调， 并导致其蛋白质的合成增加。

　　子宫内膜增生、子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的疾病， 目前认为其发生发展可能与遗传、卵巢内分泌功能、雌孕激素及其受体、生长因子、细胞凋亡、癌基因与抑癌基因、细胞免疫等有关。生长因子由其受体介导， 促进内膜细胞的有丝分裂及生长。其中IGF1 是公认的刺激子宫内膜增生的调节因子， 实验发现IGF1及受体含量与雌激素、孕激素含量均呈显著正相关， 说明IGF系统与卵巢甾体激素可能相互促进、相互协同， 共同促进子宫内膜的生长［5］。同时研究表明MXC尤其在机体内的活性代谢产物HPTE， 更具有雌激素样活性， 可与雌激素受体结合， 出现雌激素样作用， 更具有亲子宫性［6］。因此， 长期染毒MXC可能影响子宫细胞的增殖、 分化作用， 进一步造成现代社会女性子宫肿瘤疾病的高发或加重。

参考文献

　　［1］常飞， 陈必良. 环境激素类农药甲氧滴滴涕生殖毒性研究进展［J］. 国外医学·卫生学分册， 2007， 2（34）: 70-74.

　　［2］Goldman JM， Murr AS， Buckalew AR， et al. Methoxychlorinduced alterations in the histological expression of angiogenic factors in pituitary and uterus［J］. J Mol Histol， 2004， 35(4): 363-375.

　　［3］William JS， Carole SW， William DJ. Response of adult murine uterine epithelium to 50% methoxychlor［J］. Reprod Toxicol， 1994， 8(1): 81-87.

　　［4］Xue N， Xu X， Jin Z， et al. Screening 31 endocrine disrupting pesticides in water and surface sediment samples from Beijing Guanting reservoir［J］. Chemosphere， 2005， 61(11) : 1594-1606.

　　［5］Inoue A， Takeuchi S， Takahashi S. Insulinlike growth factorI stimulated DNA replication in mouse endometrial stromal cells［J］. J Reprod Dev， 2005， 51(3): 305-313.

　　［6］van Meeuwen JA， van den Berg M， Sanderson JT， et al. Estrogenic effects of mixtures of phyto and synthetic chemicals on uterine growth of prepubertal rats［J］.Toxicol Lett， 2007， 170(2): 165-176.