小鼠CXCR4基因启动子的克隆和报告基因载体构建

【摘要】 目的: 克隆小鼠CXCR4基因启动子， 并建立CXCR4报告基因系统。方法: 设计合成PCR引物， 从小鼠基因组DNA中扩增并克隆小鼠CXCR4基因的启动子区。序列测定确认后， 用克隆的启动子片段构建CXCR4荧光素酶报告基因载体pGLCXCR4。转染细胞， 用双报告基因系统检测报告基因载体的活性。结果: 成功扩增了小鼠CXCR4基因的启动子区。克隆入质粒载体后经DNA序列测定证实了其序列。通过转染细胞和荧光素酶分析， 证实所构建的报告基因可以反映CXCR4启动子的活性。结论: 成功扩增、 克隆了小鼠CXCR4基因启动子， 并成功建立起其报告基因系统， 为后续的研究奠定了基础。

【关键词】 CXCR4; 基因; 启动子; 报告基因

趋化因子受体CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子1（CXCL12）的特异受体。CXCL12对淋巴细胞等细胞有强烈的趋化作用［1］。CXCR4是最初用来分离纯化艾滋病毒的几个趋化因子受体之一。另外， CXCR4还可能人类胚胎发育中的着床过程中起作用。CXCL12是CXCR4的配体， 绝大数趋化因子受体有多个配体， 一个趋化因子可以结合到两个或多个受体。而CXCR4和CXCL12比较特殊， 它们是一对一的受体配体关系。CXCL12在造血干细胞移居骨髓中在起到重要作用。例如， 影响或阻断CXCR4受体配体结合， 可以调节造血干细胞的迁徙， 这对骨髓造血干细胞移植可能十分有用。此外， 研究还发现， 体内抑制CXCR4的表达将引起pDC及其前体细胞数量的减少。而给予CXCL12则可以促进前体细胞向pDC分化［2］。其他小组的结果证实CXCR4可以调控DC的成熟与存活， 使用CXCR4的抑制剂可以抑制骨髓来源DC的生成， 尤其可以减少其中成熟DC的比例［3］。CXCR4基因剔除小鼠在胚胎发育早期死亡， 伴随有多种组织器官的发育障碍， 说明了CXCR4具有广泛而重要的生物学功能［4］。作为发育过程最为重要的调控分子之一， 其表达必定受到严格的调控。最近， 我们在研究造血系统发育中发现小鼠CXCR4的表达在骨髓的前体细胞和外周的成熟细胞之间可能不同（待发表）。这一结果提示在前体细胞和成熟细胞之间可能存在CXCR4表达的动力学调控。为了探索CXCR4启动子在其中的可能作用， 本研究克隆了小鼠的CXCR4基因启动子， 并利用克隆的启动子片段构建报告基因系统。

1 材料和方法

　　1.1 质粒、 细菌品系和细胞系 T克隆载体pMD18T和报告基因载体pGL3Basic分别购自TaKaRa公司和Promega公司。NIH3T3细胞系由本室保存。大肠杆菌DH5a由本室保存。DualLuciferase Reporter Assay Kit购自Promega公司。

　　1.2 细胞培养和转染 NIH3T3细胞用Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)培养基（补充100 mL/L胎牛血清和2 mmol/L的L谷氨酰胺）在50 mL/L CO2 37℃， 饱和湿度条件下进行培养。细胞转染用脂质体（Lipofectamine 2000， 购自Invitrogen公司）介导进行。细胞培养于6孔板中。当细胞生长至85%接触时， 更换培养液， 然后缓慢滴加脂质体DNA混合液。培养6 h后再次更换培养液， 并继续培养至下一步试验。

　　1.3 基因组DNA提取和PCR 取0.5 cm小鼠尾巴剪碎， 加入消化缓冲液（10 mmol/L TrisCl， 10 g/L SDS， 25 mmol/L EDTA， 75 mmol/L NaCl）500; 小心吸取上清约340 μL， 加入冰无水乙醇680 μL， 反复μL、 蛋白酶K 100 μg， 55℃消化过夜。消化完全的鼠尾组织， 12 000 r/min离心5 min， 收集上清液约490 μL， 加入饱和平衡酚490 μL， 40 r/min颠倒混匀30 min， 12 000 r/min离心10 min。同法进行酚氯仿和氯仿抽提， 然后加入无水乙醇， 混匀沉淀， 12 000 r/min离心5 min， 弃上清， 750 mL/L乙醇洗涤后50℃烘干1 min左右， 待乙醇挥发后， 加入100 μL灭菌去离子水， 50℃ 30 min溶解， -20℃保存。利用以下引物扩增小鼠CXCR4基因的启动子区-703～+77片段: CXCR4 F: 5′GGCTAGCTTCCCAGCTGGGAC; CXCR4R: 5′AACACTCGCTCTACAGCCGTGGTGG。

　　1.4 分子克隆 DNA酶切、 连接、 大肠杆菌转化等分子克隆操作完全按照《分子克隆》一书进行。DNA序列分析委托TaKaRa公司进行。

　　1.5 报告基因试验 NIH3T3细胞进行常规细胞培养， 转染前2×104/孔接种入96孔板， 每孔应用脂质体Lipofectamine 2000转染0.1 μg报告质粒和5 ng phRLTK质粒， 以及不同剂量的pEFBOSNIC（表达Notch受体胞内段NIC）［5］。48 h后， 根据DualLuciferase Reporter Assay Kit 的使用说明书检测荧光素酶的活性， 实验过程中内参照为海肾荧光素酶活性。

2 结果

　　2.1 小鼠CXCR4基因启动子的扩增和克隆 为了构建小鼠CXCR4基因的报告基因质粒， 从小鼠基因组DNA中扩增并克隆了小鼠CXCR4基因启动子区片段。首先根据GenBank公开的序列资料设计了小鼠CXCR4基因启动子区的PCR引物。提取小鼠基因组DNA， 利用设计的引物从中扩增了小鼠CXCR4基因启动子区片段。对扩增产物进行凝胶电泳显示PCR反应扩增出符合预期大小条带， 大小约830 bp， 符合小鼠CXCR4基因启动子区大小（图1A）。进而从凝胶中回收了扩增的条带， 插入T克隆载体， 获得阳性克隆后（图1B）， 进行了DNA序列分析。结果表明所获得的扩增产物与公布的小鼠CXCR4基因启动子区的序列完全吻合（结果未显示）。

　　2.2 小鼠CXCR4报告基因的构建 利用获得的CXCR4基因启动子片段构建了CXCR4启动子报告基因。为此利用限制性内切酶将包含有基本启动子的CXCR4上游调控片段从克隆载体上切下， 插入报告基因质粒pGL3basic的多克隆位点， 得到CXCR4报告基因载体pGLCXCR4（图2A）: 在CXCR4调控区下游是荧光素酶基因， 再下游为polyA加尾信号， 以保证荧光素酶基因的有效表达。用限制性内切酶酶切鉴定， 见所构建的报告基因载体具有正确的结构（图2B）。

　　2.3 小鼠CXCR4基因启动子活性的检测 为了验证构建的小鼠CXCR4报告基因的活性， 进行了细胞转染试验和体外荧光素酶活性检测实验。小鼠成纤维细胞NIH3T3表达CXCR4（结果未显示）。因此分别将pGLCXCR4和pGL3Basic转染至NIH3T3细胞。转染48 h后获得细胞裂解液进行荧光素酶活性分析， 发现在转染pGLCXCR4的细胞中有明显的荧光素酶活性表达（图3A）， 提示pGLCXCR4中的荧光素酶基因被CXCR4启动子所激活。最近研究发现， Notch信号激活可以上调CXCR4的表达。因此将所构建的pGLCXCR4与表达Notch受体胞内段的真核表达载体pEFBOSNIC一起转染NIH3T3细胞， 转染48 h后收获细胞， 用双荧光报告基因系统检测细胞裂解上清液中荧光素酶的活性， 结果发现， 随着转染的质粒pEFBOSNIC的量的增加， 荧光素酶的活性液逐渐增加， 说明CXCR4基因启动子确可以被表达的NIC所激活， 提示我们构建的小鼠CXCR4基因启动子报告基因可以反映CXCR4启动子的活性（图3B）。

3 讨论

　　在本研究中， 我们成功克隆了小鼠CXCR4基因的启动子区序列， 并通过DNA序列分析证实了其正确性。我们将克隆的小鼠CXCR4基因启动子片段插入质粒pGL3Basic的多克隆位点， 获得了CXCR4的报告基因载体pGLCXCR4。经转染小鼠成纤维细胞NIH3T3， 我们发现我们构建的报告基因载体可以被表达CXCR4的NIH3T3细胞所激活。此外， 该报告基因载体还可以被Notch受体的胞内段（代表激活的Notch受体）所激活。这些结果提示我们所构建的报告基因载体至少可以在一定程度上反映CXCR4启动子的活性。

　　最近， Willianms等［6］报道在血管内皮细胞中， CXCR4可能受到内皮细胞调控信号途径的调控。该研究组发现在培养的内皮细胞中转染Notch配体Deltalike1（Dll1）可以激活Notch信号， 同时可以下调CXCR4的表达。而用Notch信号的阻断剂 分泌酶抑制剂（GSI）可以显著上调CXCR4的mRNA和蛋白质水平。然而我们最近未发表的结果显示， 虽然Notch信号在成熟的内皮细胞中抑制CXCR4表达， 但在骨髓中的内皮祖细胞上却是CXCR4表达的促进因素。那么， Notch信号是否作用于CXCR4的启动子？以及如何调控调控CXCR4的转录激活？本研究建立的CXCR4报告基因载体将为深入探讨这些问题奠定基础。

参考文献

［1］ Petit I， Jin D， Rafii S. The SDF1CXCR4 signaling pathway: a molecular hub modulating neoangiogenesis［J］. Trends Immunol， 2007， 28: 299-307.

［2］ Sallusto F， Schaerli P， Loetscher P， et al. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation［J］. Eur J Immunol， 1998， 28: 2760.

［3］ Kabashima K， Shiraishi N， Sugita K， et al. CXCL12CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells［J］. Am J Pathol， 2007， 171: 1249.

［4］ Ceradini DJ， Kulkarni AR， Callaghan MJ， et al. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF1 induction of SDF1［J］. Nat Med， 2004， 10: 858-864.

［5］ Hongyan Q， Jishu W， Yingmin L， et al. RING1 inhibits transactivation of RBPJ by Notch through interaction with LIM protein KyoT2［J］. Nucleic Acids Res， 2004， 32: 1492-1501.