TRBP及其截短体真核表达载体的构建与表达

　　　　作者：韩涛 张勇 孙书明， 孟艳玲， 李伟， 郭张燕， 杨安钢

【摘要】 目的: 构建TRBP及其截短体真核表达载体， 并检测其在HeLa细胞中的表达。方法: 设计引物扩增TRBP全长及其截短体TAB、 TAC、 TBC基因序列， 然后将各基因片段克隆入真核表达载体pFlagCMV4。用脂质体法转染HeLa细胞， 经 Western blot方法检测目的基因在转染细胞中的表达。结果: 经过酶切鉴定与测序证实， TRBP全长及其截短体TAB、 TBC、 TAC基因真核表达载体构建成功， 经Western blot可检测转染细胞中各基因的表达。结论: 成功构建了TRBP全长基因及其截短体TAB、 TAC和TBC基因真核表达载体， 在转染细胞中可以检测到目的基因的表达。

【关键词】 TRBP; RISC; miRNA; 真核表达

TRBP（TAR RNA binding proteins）首先作为HIV1反式激活应答(transactivation response， TAR)RNA结合蛋白被分离鉴定出来。TRBP全长366aa， 属于dsRNA结合蛋白家族， 具有3个dsRBD， 位于dsRBD2内部的KR螺旋模序负责RNA结合， 第3个结构域即C末端碱性结构域主要介导蛋白质间的相互作用［1］。TRBP具有多种生物学功能， 包括调控精子生成与发育、 抑制PKR激活、 调节HIV1基因表达、 参与RNAi（RNA interferenc）过程等。TRBP是PKR的强抑制物， 它通过直接结合和dsRNA扣押而发挥作用。TRBP不依赖PKR而依赖结构RNA， 对翻译也有直接作用［2］。TRBP促进HIV1的表达和复制， 在星形胶质细胞中PKR的高应答导致了HIV1的低复制和病毒结构蛋白的翻译低下， 而TRBP抑制PKR激活， 使病毒蛋白产生恢复， 从而增强了HIV复制。研究表明TRBP通过对抗PKR介导的抗病毒免疫而在病毒翻译中具有关键作用［3］。

　　TRBP、 Ago2和Dicer都在miRNA加工和RNAi中发挥作用。TRBP在dsRNA和Dicer之间募集Ago2时起到桥梁作用， TRBP或Dicer缺失后成熟miRNA产生减少和siRNA功能的丧失， 他们推断TRBP募集Ago2到RISC， 将RNAi的启动和执行阶段相偶联［4］。TRBP与RNaseⅢ家族成员Dicer相互作用， 并结合dsRNA， 随后结合具有裂解dsDNA活性的Ago2蛋白， 它们共同组成RISC复合体（RNAinduced silencing complex）。dsRNA的一条链被递呈给Ago2蛋白从而导致siRNA 和miRAN的产生［5］。

　　在人细胞中TRBP是Dicer结合蛋白， 它为siRNA及miRNA功能的发挥所必需。为了进一步探讨TRBP与Ago2间的相互作用和miRNA的生成机制， 我们构建了TRBP全长及其截短体TAB、 TAC和TBC基因真核表达载体， 并在转染细胞中检测到了目的基因的表达， 为进一步研究其功能机制奠定了基础。

1 材料和方法

　　1.1 材料 E.coli DH5α菌种、 细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存和培养。载体pFlagCMV4由本室保存， Taq DNA聚合酶、 DNA限制性核酸内切酶、 T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司、 新生牛血清购自杭州四季青生物公司。RPMI1640及脂质体LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司。小鼠抗Flag单克隆抗体(mAb)购自Sigma公司。HRP标记山羊抗小鼠二抗购自中杉公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 根据TRBP的基因序列设计引物为X1 (5′TTT G GTA CCC ACC ATG AGT GAA GAG GAG CAA GGC TCC GGC ACT ACC ACG GGC TGC3′)， X2（5′TTT TCT AGA GTC GAC TCA CTT GCT GCC TGC CAT GAT CTT3′）， X6(5′TTT GGT ACC GGG AGC ATG CTG GAG CCG3′)， X5(5′TTT TCT AGA ATC CCG GGC ATC CAG AGG3′)， X8(5′GCC CTC AAA CAC CTC AAA GGG GTG CCT CTG GAT GCC CGG GAT3′)和X9(5′ATC CCG GGC ATC CAG AGG CAC CCC TTT GAG GTG TTT GAG GGC3′)。

　　1.2.2 RTPCR 收集处于对数期生长的细胞， 使用TRIzol试剂提取总RNA ， 使用SuperScriptTM FirstStrand System for RT PCR试剂盒进行反转录， 操作均按说明书进行。获取基因组cDNA。

　　1.2.3 pCMVTRBP、 pCMVTAB、 pCMVTBC、 pCMVTAC真核表达载体的构建 以cDNA为模板， 用X1和X2进行PCR， 扩增出TRBP全长基因， 分别用X1和X5， X6和X2， 扩增出TAB段和TBC段， 并分别用X1和X9， X8和X2， 扩增出TAC段。用EcoRⅠ和XbaⅠ分别双酶切pCMV4与TRBP基因， 用KpnⅠ和XbaⅠ分别双酶切pCMV4和TAB、 TBC、 TAC基因片段， 胶回收， T4 DNA连接酶连接， 并转化E.coli DH5α菌株， 挑克隆， 提取质粒， 酶切鉴定， 鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序， 将测序正确的质粒命名为pCMVTRBP、 pCMVTAB、 pCMVTBC、 pCMVTAC。

　　1.2.4 细胞转染 于细胞转染前24 h， 用胰酶消化生长至对数期的细胞， 置于细胞培养瓶中培养， 待细胞达80%汇合率时进行转染。先用无血清RPMI1640洗2次， 加500 μL无血清RPMI1640， 分别将8 μg pCMVTRBP、 pCMVTAB、 pCMVTBC、 pCMVTAC和20 μL LipofectAMINETM2000分别加于500 μL无血清RPMI1640中， 轻轻振摇混匀， 制成转染液， 室温静置20 min后， 将转染液加入细胞中， 轻轻混合， 置37℃孵育6 h， 弃去转染液， 加含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640。于转染后48 h后， 收集细胞。

　　1.2.5 Western blot检测 将转染的各组细胞， 用RIPA裂解， 处理蛋白样品， 加入5×上样缓冲液， 煮沸。将已处理好的蛋白样品进行SDSPAGE电泳， 电压分别为浓缩胶100 V， 分离胶120 V、 100 mA转移1 h至NC膜上。将NC膜在封闭液（30 g/L BSA in TBS）中， 在室温下缓慢摇动封闭1 h。加入1∶1 000的小鼠抗Flag mAb， 4℃过夜。用TBST洗膜， 5 min×3次。加入1∶2 000的HRP标记的山羊抗小鼠二抗， 室温放置1 h， TBST洗膜， 5 min×3次。加入发光液， 暗室内压片， 显影， 定影。

2 结果

　　2.1 TRBP及其各截短体结构 TRBP全长366aa， 属于dsRNA结合蛋白家族， 具有3个dsRBD， 分别为dsRBD A， dsRBD B和dsRBD C。位于dsRBD2内部的KR螺旋模序负责RNA结合， 第3个结构域即C末端碱性结构域主要介导蛋白质间的相互作用。依据TRBP的结构基础， 我们构建了TRBP及其截短体TAB， TBC和TAC真核表达载体（图 1）。

　　图1 TRBP及其各截短体结构示意图

　　2.2 pCMVTRBP、 pCMVTAB、 pCMVTBC、 pCMVTAC的克隆及鉴定 以cDNA为模板， 用引物X1和X2进行PCR， 扩增出约为1 100 bp的片段， 用引物X1和X5进行PCR， 扩增出约为700 bp的片段， 用引物X6和X2进行PCR， 扩增出约为800 bp的片段， 并分别用X1和X9、 X8和X2进行PCR， 扩增出约为700 bp的片段。（图2）， 与预期大小一致， 将约为1 100 bp的片段经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后， 连接入经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后的pCMV4载体中， 其余3个片段经Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ分别双酶切后， 连接到经Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后的pCMV4载体中， 分别用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切， KpnⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定， 测序证实我们所获得的序列完全正确， 载体pCMVTRBP、 pCMVTAB、 pCMVTBC、 pCMVTAC构建成功(图3)。

　　2.3 转染HeLa细胞中TRBP分子的表达 于细胞转染前24 h， 用胰酶消化生长至对数期的细胞， 置于细胞培养瓶中培养， 待细胞达80%汇合率时进行转染。分别将8 μg pCMVTRBP、 pCMVTAB、 pCMVTBC、 pCMVTAC和20 μL LipofectAMINETM2000分别加于500 μL无血清RPMI1640中， 振摇混匀制成转染液， 室温静置20 min后， 将转染液加入到用无血清RPMI1640洗过的细胞中， 混合后置于37℃孵育6 h， 弃去转染液， 加含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培养。转染48 h后， 收集裂解细胞， 用抗Flag抗体， 以及HRP标记的二抗进行Western blot检测， 结果检测到全长TRBP相对分子质量（Mr）约为45 000， 以及3个截短体TAB， TBC， TAC Mr分别为29 700、 30 900、 34 000（图4）， 同预期结果相符， 表明目的蛋白能够在转染细胞中表达。

　　3 讨论

　　miRNA作为一种发挥RNAi作用的小RNA， 是一类长度21～23 nt， 进化上比较保守的非编码小RNA分子。miRNA的前体RNA分子都可形成颈环结构的双链区， 继而经过Drosha、 RNase Ⅲ和Dicer的对其加工和细胞核．质的转运， 最终形成长约为21～23 nt 的成熟的miRNA。成熟的miRNA与一些相关蛋白形成RISC， 通过与其互补或部分互补的靶mRNA的3UTR区结合， 使靶mRNA降解或介导其翻译抑制［6］。miRNA还在众多细胞过程和生物学行为中发挥作用， 如细胞增殖， 分化与死亡等［7］。并在抗病毒感染免疫、 维持基因组中转座子的稳定性、 清除异常RNA及基因表达调控中会发挥作用， 而在肿瘤中观察到miRNA的表达水平异常或发生突变， 提示这类小的核酸分子可能发挥类似癌基因或抑癌基因的作用。

　　miRNA基因通常是由RNA聚合酶II(Pol II)转录的， 一般最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的primiRNA。这些primiRNA在RNase III Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被加工成约70 nt 的premiRNA前体产物。RANGTP和exportin 5将这种前体分子输送到细胞质中。随后， 另一个RNase III Dicer 将其剪切产生约为22 nt 的miRNA: miRNA*双链。这种双链很快被引导进入miRISC复合体中， 其中含有Ago2和TRBP蛋白， 这一复合物加工生成成熟的单链miRNA［8］。

　　但是， miRNA具体的生成机制尚不是很清楚。目前， 许多实验都证实TRBP参与RISC复合体的形成和miRNA的加工过程， 利用Dicer、 TRBP和Ago2体外重组的RISC也同样具有miRNA的加工作用［9］。但是TRBP与Ago2相互作用机制也不是很清楚， 以及哪个结构域发挥作用、 如何结合miRNA链仍是未知。为了研究这些问题， 本课题构建了TRBP及其截短体重组基因的真核表达载体， 转染Hela细胞证实TRBP截短体重组基因的表达， 为进一步研究TRBP分子与Ago2分子相互作用的机制， 进而阐述TRBP在miRNA生成中的作用制奠定了基础。

参考文献

［1］ Daviet L， Erard M， Dorin D， et al. The analysis of a binding difference between the two dsRNA binding domains in TRBP reveals the modular function of a KRhelix motif［J］. Eur J Biochem， 2000， 267(8): 2419-2431.

［2］ Park H， Davies MV， Langland JO， et al. TAR RNAbinding protein is an inhibitor of the interferoninduced protein kinase PKR［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1994， 91(11): 4713-4717.

［3］ Ong CL， Thorpe JC， Gorry PR， et al. Low TRBP levels support an innate human immunodeficiency virus type 1 resistance in astrocytes by enhancing the PKR antiviral response［J］. J Virol， 2005， 79(20): 12763-12772.

［4］ Chendrimada TP， Gregory RI， Kumaraswamy E， et al. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing［J］. Nature， 2005， 436(7051): 740-744.

［5］ Haase AD， Jaskiewicz L， Zhang H， et al. TRBP， a regulator of cellular PKR and HIV1 virus expression， interacts with Dicer and functions in RNA silencing［J］. EMBO Rep， 2005， 6(10): 961-967.

［6］ Ambros V. The function of animal microRNA［J］. Natrue， 2004， 431(7006): 350 -355.

［7］ Bartel DP. MicroRNA: Genomic， biogenesis， mechanism and function［J］. Cell， 2004， 116(2): 281-297.

［8］ EsquelaKerscher A， Slack FJ. OncomirsmicroRNAs with a role in cancer［J］. Nat Rev Cancer， 2006， 6(4): 259-269.