N糖基化修饰对突触细胞黏附分子SynCAM调节突触可塑性的影响

【摘要】 目的: 观察N糖基化对突触细胞黏附分子(SynCAM)调节突触形成作用的影响。方法: 制备SynCAM N糖链定点突变质粒和正常SynCAM表达质粒转染海马神经元细胞， 膜片钳试验观察突触中的转染质粒的海马神经元作为突触后部分其动作电位的潜伏期和频率。结果: 突变SynCAM质粒组海马神经元动作电位潜伏期为(180.9±3.5)ms(n=14)， 频率为(10.2±0.7)/s (n=14)。正常SynCAM质粒组海马神经元动作电位潜伏期为(174.7±4.8) (n=14)， 动作电位频率为(10.0±0.8)/s(n=14)， 差异无统计学意义。结论: 有无N糖链缺失的SynCAM对突触功能的影响无明显差别， 下游信号蛋白可能影响SynCAM调节功能。

【关键词】 SynCAM; N糖基化修饰; 突触后电活动

突触细胞黏附分子(SynCAM)是最近发现的大脑特异性表达的细胞黏附分子(CAM)[1]， 属于免疫球蛋白超家族的一员， 主要是分布在突触前后膜作为同嗜黏附分子跨越突触间隙[2]。在大鼠实验中发现新出生大鼠脑中没有发现表达SynCAM蛋白， 但出生后3周内之一突触形成的重要时期表达量增加[3]。海马CA1区神经元内保持一定钙离子浓度是维持突触可塑性是必须条件[4]。SynCAM的引人之处在于其活动不仅局限于黏附， 而且是非钙依赖的， 同时还参与突触的融合和分化。研究发现SynCAM Ig样结构域对其调节作用影响重大， 而分析Ig样结构域发现存在N糖基化修饰位点， 并且SynCAM只受N糖基化修饰。由于N糖基化修饰在参与细胞与细胞黏附、 识别以及蛋白受体调节的细胞表面蛋白中发挥着重要作用， 因此我们通过定点突变造成SynCAM胞外Ig样结构域N糖基化修饰缺失， 转染海马神经元， 通过电生理试验观察海马神经元突触后电活动的差异， 进行N糖基化调节SynCAM突触功能的初步研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 孕15～16 d雌性SD大鼠由上海医科大学实验动物中心提供。DMEM/F12培养基、 EGF、 bFGF、 B27胎牛血清购自GIBCO公司。多聚赖氨酸， 2.5 g/L胰蛋白酶消化液、 Goat antirabbitFITC、 Donkey antiratTex、 DAPI 、 Triton X100和SynCAM/TSLC1购自sigma公司。dNTPS、 EcoR I和Xho I购自Promega公司。PCR试剂和Taq polymerase购自TaKaRa。纯化试剂盒、 小量抽提试剂盒、 凝胶回收试剂盒购于中科开瑞公司。大抽质粒试剂盒购自Qiagen。QuikChange SiteDirected Mutagenesis Kit购自Stratagene公司。磷酸钙共沉淀转染试剂盒购自北京博大泰恒技术公司。PNGase F试剂盒购自Seikagaku公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 原代海马神经元的分离培养 分离培养前晚上用多聚赖氨酸包被盖玻片， 无菌操作并备用。新生24 h的SD大鼠无菌条件下断头处死取全脑， Dhanks液洗数次; 分离海马组织， 置于冰浴的Dhanks液中， 充分剪碎组织; 加入同体积1.25 g/L的胰蛋白酶， 消化20 min左右; 胎牛血清终止消化， 轻轻吹打细胞数分钟， 150目网筛过滤， 收集细胞悬液; 以1 100 r/min离心5 min， 倾去上清， 用DMEM/F12培养液重悬细胞， 轻轻吹打， 计数， 调整细胞密度为(2～5)×103/cm2， 加入终浓度为100 mL/L胎牛血清后接种于放有盖玻片的培养皿中， 置于37℃、 含50 mL/L CO2培养箱中培养; 12 h内禁止晃动。接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液， 至48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷， 以抑制非神经元细胞的过度生长， 随后每3 d半量换液。

　　1.2.2 星形胶质细胞的培养纯化 P3 SD大鼠低温麻醉后乙醇消毒， 无菌操作下取大脑皮层并除去脑膜， 剪碎组织， 加入1.25 g/L胰酶消化20 min， 用滴管吸出组织转移到装有冷的含100 mL/L FBS MEM的离心管内终止胰酶作用5 min， 吸出组织转移到另一支装有冷的100 mL/L FBS MEM的离心管内， 吹打数次， 静置后取上清并吸到另一支离心管内， 重复上述步骤2次或3次， 所得上清于800 r/min离心5 min， 弃上清， 管内加入新鲜100 mL/L FBS MEM并吹打成单细胞悬液， 细胞计数， 调整细胞密度培养， 每隔2～3 d进行全量换液， 第9日换液后放入孵箱24 h， 于37℃恒温摇床上280 r/min 18 h。吸去悬液， DHanks液洗2次后常规传代， 种入12孔培养板。

　　1.2.3 SynCAM糖基化位点突变质粒构建及鉴定 利用SynCAM全长基因作为模板， 对糖基化位点104位、 116位、 168位和311位存在N糖基化修饰位点， 内含引入的点突变核苷酸序列。PCR反应体系为: 50 (灭菌水34.5 μL， 10×Buffer 5 μL， 10 mmol/L dNTP 4 μL， 纯化回收的两个片段各2 μL， 83.35 nkat高保真Taq酶0.5 μL)， 反应条件为: 94℃ 预变性5 min， 94℃变性l min， 48℃退火2 min， 72℃延伸2 min， 循环10次后， 进行PCR反应， 扩增104位点突变基因产物SynCAM 104。同样方法， 可获得116位点、 118位点和311位点突变基因产物， 以及双点突变基因产物。将所有上述突变体产物回收， 连接pMD18T vetor， 转化DH5a感受态、 质粒提取、 Xho I和EcoR I双酶切筛选阳性重组子， DNA测序。将测序后的重组质粒克隆载体酶切回收， 与真核表达载体pcDNA3.1 (+)和pCMVIRESEGFP连接， 连接产物经转化、 扩增、 酶切鉴定等步骤， 大量制备质粒。经Western blot及PNGase F糖苷酶鉴定质粒构建及点突变情况。

　　1.2.4 转染海马神经元膜片钳实验 转染前向12孔板每孔加2 μL胶质细胞培养基， 于50 mL/L CO2的37℃培养箱孵育20～24 h。将种有海马神经元的盖玻片转入12孔板， 转染前1 h换液。灭菌的1.5 mL EP管内混合60 μL 2 mol/L CaCl2与5 μg质粒DNA， 处理每片盖玻片。室温下将以上溶液与等体积的2 ×HBS盐溶液混合。立刻盖上盖子， 倒转往复混匀后静置， 室温下5 min; 将上述EP管中的液体加入单层星形胶质细胞12孔板中共培养， 轻轻混匀。37℃培养过夜， 次日换液。转染细胞48～72 h后， 利用全细胞膜片钳技术分析不同质粒转染海马神经元的突触后电生理活动是否有差别情况。主要指标是判断去极化反应的幅度和反应时间， 对比同时间段神经元之间突触的反应。选取大小适中(直径20～30 μm)的海马神经元细胞， 在室温下(22～25℃)进行实验。入水阻抗为2～ 10 MΩ， 封接阻抗达1 GΩ以上， 电极内负压打孔， 形成全细胞记录模式。灌流液中加入CaCl2(0.1 mmol/L)及4AP(0.1 μmol/L)以阻断Ca2+和K+通道。细胞膜电位钳制在-70 mV， 以步长20 mV的阶跃方波脉冲刺激从-80 mV除极至+100 mV， 脉冲持续时间为400 ms。

　　1.2.5 统计学分析 膜片钳电流的测量分析用Clampfit 9.0软件， 数据统计使用SPSS 6.0软件。所有数据均用x±s表示， 进行配对t检验和两组独立样本的t检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 SynCAM糖基化位点突变质粒的构建和鉴定 定点突变糖基化位点Asn或Thr， 获得104位点突变的SynCAM 104基因、 116位点位点突变的SynCAM 116基因、 双位点突变基因SynCAM104116、 168位点突变的SynCAM 168基因、 311位点突变的SynCAM 311基因、 双位点突变基因SynCAM168311。PCR扩增所用的引物及其序列: P1 5′ATAGAATTCATGGCGAGTGCTGTGCT3′， P2 5′GAAGGTACCGATGAAGTACTCTTTCTT3′; P1SynCAM104 5′CGCTTTCAGCTGCTGGCGTTTAGCAGCAGCGAACTG 3′， P2 SynCAM104 5′CAGTTCGCTGCTGCTAAACGCCAGCAGCTGAAAGCG3′; P1SynCAM116 5′GTGAGCCTGACCGGGGTGAGCATTAGCGATGAAGGC3′， P2SynCAM116 5′GCCTTCATCGCTAATGCTCACCCCGGTCAGGCTCAC3′; P1SynCAM168 5′GAAGAAATTGAAGTGGGGTGCACCGCGATGGCGAGC3′， P2SynCAM168 5′GCTCGCCATCGCGGTGCACCCCACTTCAATTTCTTC3′; P1SynCAM311 5′AACAACCTGGGGAAAACCGATAACGGCACCTATCGCTGC3′; P2SynCAM311 5′GCAGCGATAGGTGCCGTTATCGGTTTTCCCCAGGTTGTT3′。利用SynCAM基因作为模版， 采用PCR技术配合重复延伸方法， 产生Mr约750 bp的SynCAM104和SynCAM116片段; Mr约500 bp的SynCAM104116; SynCAM104116; Mr约1 000 bp的SynCAM168和SynCAM311片段; Mr约800 bp的SynCAM168311(图1)。

　　图1 PCR琼脂糖凝胶电泳

　　1: Marker; 2: 104点突变SynCAM组; 3: 116点突变SynCAM组; 4: 104116点突变SynCAM组; 5: 168点突变SynCAM组; 6: 311点突变SynCAM组; 7: 168311点突变SynCAM组; 8: 四点突变 SynCAM104116168311.

　　2.2 Western blot分析 Western blot结果显示， 正常糖修饰SynCAM蛋白有多个条带， Mr为68 000附近， 4种糖基化单点突变型蛋白出现在60 000左右的位置。去N糖基化突变蛋白不具备糖基化形式， 只产生单一的条带， Mr在48 000附近(图2)。

　　图2 Western blot法鉴定

　　0: 正常SynCAM; 1: SynCAM104; 2: ynCAM116; 3: SynCAM168; 4: nCAM311; 5: nCAM104116; 6: SynCAM168307; 7: SynCAM104116168311.

　　2.3 记录转染细胞动作电位潜伏期和个数 突触后神经元的突触后动作电位频率主要取决于突触的数目和递质释放概率， 而动作电位幅度反映了突触后受体的数目。将转染质粒的海马神经元细胞的膜电位钳制在-70 mV， 给予-80～+100 mV的除极刺激时， 可以触发一个随电压增大而增大的外向电流。当钳制电流在+100 mV 时， 外向电流为(422.78±68.87)pA。

　　3 讨论

　　CAM是一类细胞表面的跨膜蛋白， 参与细胞与细胞、 细胞与细胞外基质的黏附。研究表明各种不同的CAM大量存在于海马的前后突触的膜， 已知有少数的几种黏附分子可通过调节相互作用直接诱导突触形成[4]。黏附分子的N糖基化修饰在细胞的识别、 黏附以及蛋白受体调节的细胞表面蛋白中发挥着重要作用[5]。研究表明SynCAM只有N糖链修饰[1]， 所以本研究我们应用定点突变N糖链修饰位点， 构建突变质粒转染海马神经元细胞。突触后神经元的突触后动作电位频率主要取决于突触的数目和递质释放概率， 而动作电位幅度反映了突触后受体的数目。经过本实验我们发现有无N糖基化修饰对于SynCAM调节突触功能的影响无明显区别， 表明SynCAM调节突触形成的作用与N糖基化修饰没有相关性。SynCAM是进化保守的跨膜分子[4]， 包含3个细胞外Ig结构域和PDZ 结合域， SynCAM的C末端可以与CASK和syntenin进行胞内作用[6]， 结构域中有一种功能域序列可以与细胞内骨架蛋白结合， 其下游信号分子仍是未知的[7]。本研究得出的结论促使之后的研究方向可以向以下方向进行， 如SynCAM本身细胞外PDZ结合域的作用机制或者下游作用信号蛋白的相互作用有关

参考文献

　　[1] Biederer T， Sara Y， Mozhayeva M， et al. SynCAM， a synaptic adhesion molecule that drives synapse assembly[J]. Science， 2002， 297: 1525-1531.

　　[2] Yamagata M， Sanesy JR， Weinerz JA. Synaptic adhesion molecules[J]. Curr Opin Cell Biol， 2003， 15: 621-632.

　　[3] Washbourne P， Dityatev A， Scheiffele P， et al. Cell adhesion molecules in synapse formation[J]. J Neurosci， 2004， 24: 9244-9249.

　　[4] Goda1 Y， Graeme W. Davis mechanisms of synapse assembly and disassembly[J]. Neuron， 2003， 40: 243-264.

　　[5] Fox MA， Umemori H. Seeking longterm relationship: Axon and target communicate to organize synaptic differentiation[J]. J Neurochem， 2006， 97: 1215-1231.

　　[6] Biederer T， Su¨dhof TC. Cask and protein 4.1 support Factin nucleation on neurexins[J]. J Biol Chem， 2001， 276: 47869-47876.

　　[7] Ito A， Oonuma J. Direct interaction between nerves and mast cells mediated by the SgIGSF/SynCAM adhesion molecule[J]. J Pharmacol Sci， 2006， 102: 1-5ISSN1007-8738