雷公藤内酯醇对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞IL18及其受体表达的影响

　　　　　　 作者：毛晓丹， 孙赛君， 裴紫燕， 张立煌

【摘要】 目的: 研究雷公藤内酯醇(TP)对佛波酯(PMA)刺激的关节滑膜成纤维细胞(RASF) 白细胞介素18(IL18)及其受体（IL18R）表达的影响， 并对其机制进行探讨。方法: RASF先用TP(0～100 μg/L) 预处理2 h， 再用PMA (50 μg/L)刺激。收集上清用 ELISA 法检测上清IL18水平。利用人IL18能特异诱导人髓系单核细胞KG1产生IFNγ的特性检测上清中IL18生物学活性。收集处理的RASF， 用Western blot 和荧光定量RTPCR检测IL18和IL18R的蛋白和mRNA表达。NFκB的活性用类ELISA法检测。 结果: TP能有效抑制PMA刺激的RASF的IL18生物学活性。TP能够抑制PMA刺激的RASF的IL18和IL18R的蛋白和mRNA表达。TP还抑制PMA刺激的RASF 的NFκB 活性。TP对PMA刺激的RASF 的抑制效应呈剂量相关性。结论: TP能有效抑制PMA刺激的RASF 的IL18和IL18R的表达。这些结果说明了TP对RA治疗作用的机制。

【关键词】 雷公藤内酯醇; 类风湿关节炎; IL18; IL18R

　　［Abstract］ AIM: To determine the effects of triptolide (TP) on the expression of interleukin18 (IL18) and its receptor in phorbol 12myristate 13acetate (PMA)stimulated rheumatoid arthritis synovial fibroblasts (RASF). METHODS: RASF were pretreated with TP (0-100 μg/L) for 2 h before stimulation with PMA (50 μg/L). The bioactivity of IL18 in the supernatant was detected based on IFNγ secretion from IL18responding human myelomonocytic KG1 cells. IL18 level was analyzed by ELISA. To estimate the protein and mRNA expression of IL18 and IL18Rα in RASF， Western blot and quantitative RTPCR were performed. Nuclear factorκB (NFκB) activity in the wholecell extract of treated RASF was also measured using an ELISAbased method. RESULTS: TP effectively inhibited the bioactivity of IL18 in PMAstimulated RASF. The expression of IL18 and IL18R at protein and gene levels was reduced by TP. NFκB activity in PMAstimulated RASF was profoundly suppressed by TP. These effects showed a high correlation with TP concentration (0-100 μg/L). CONCLUSION: TP effectively inhibited the expression of IL18 and its receptor in PMAstimulated RASF. These results suggest a mechanism of TP in RA therapy.

　　［Keywords］triptolide; rheumatoid arthritis; interleukin18; interleukin18 receptor

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一个自身免疫性疾病， 主要表现为滑膜成纤维细胞的大量增生和炎性细胞浸润的多关节滑膜组织的慢性炎症。RA患者关节滑膜组织过度表达IL18、 TNF、 IL1等炎症细胞因子［1］， 进而激活关节滑膜成纤维细胞NFkB的活性， 促进COX2、 iNOS的大量表达， 迅速大量合成PGE2、 NO， 导致关节滑膜炎症、 肿胀、 增生、 滑膜血管翳大量生成， 最终导致关节退变， 此为RA重要的发病机制之一［2］。IL18在RA发生发展中起到重要作用［3］， 下调IL18的活性是治疗RA的一个潜在策略。

　　雷公藤为中国传统中药， 具有明显的抗炎、 抗风湿及免疫抑制作用［4］。雷公藤内酯醇（Triptolide， TP）是中药雷公藤的有效单体成分［5］， 其抗RA机制主要为抑制机体的免疫反应， 下调Th1类细胞及细胞因子的活性， 进而抑制炎症因子及炎症介质的表达。随着细胞及分子生物学研究的深入， TP抗炎及抗RA的分子机制也得到进一步的认识。我们研究TP对PMA刺激的RASF IL18及其受体（IL18R）表达的影响， 并对其机制进行探讨， 为TP抗RA治疗提供新的理论和实验依据。

1 材料和方法

　　1.1 类风湿关节滑膜成纤维细胞（RASF）的分离和培养 关节滑膜组织取材于浙江大学医学院附属医院骨科， 行膝关节置换或滑膜切除术的5例类风湿性关节炎患者， 均符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准。无菌条件下剪碎滑膜组织， 用含4.0 g/L胶原酶（Sigma）的RPMI1640培养液（Gibco）， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱孵育消化4 h， 离心收集细胞， 加含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 于37℃、 50 mL/L CO2孵育箱中培养， 使细胞贴壁。弃除未贴壁的细胞， 继续培养18 h， 贴壁细胞用DHanks彻底冲洗后， 用含2.5 g/L胰酶的消化液（Gibco）消化收集贴壁的滑膜成纤维细胞传代培养。经3～4次传代后， 用流式细胞术鉴定细胞纯度达98%以上［CD3、 CD20、 CD68、 Von Willibrand factor (第8因子相关抗原)阳性细胞＜1%］。

　　1.2 实验分组及滑膜成纤维细胞的处理 将滑膜成纤维细胞1×106/孔接种于6孔板（Falcon）中， 待细胞完全贴壁后弃上清， 用含不同浓度雷公藤内酯醇（TP， 0～100 μg/L）的培养液预处理2 h， 然后加佛波酯（PMA， 50 μg/L， Sigma）刺激， 继续培养18 h。收集各组细胞培养上清液及细胞， 备检。

　　1.3 IL18的生物活性检测 利用人IL18能特异诱导人髓系单核细胞KG1（引自美国ATCC， CCL246， 由本所常规传代保存）产生IFNγ的特性， 通过ELISA法检测培养上清液IFNγ的水平（hIFNγ ELISA Kit， 美国R&&D Systems）， 结果以IFNγ浓度反映被测样品中IL18的生物活性。按Yamamura等［6］方法操作。所有检测样品均用鼠抗人IL18单克隆抗体（D0443， 美国R&&D Systems）中和后作对照（抗体终浓度2 mg/L， 37℃作用1 h）， 以示其特异性。

　　1.4 双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 采用ELISA法， 检测培养上清液IL18（hIL18 ELISA Kit， MBL Japan）的水平。操作严格按说明进行。最后于全自动酶标仪（BioTek Elx800， 美国）读取A450值， 根据标准反应曲线求得样品IL18的水平。

　　1.5 细胞蛋白提取及Western blot检测 收集细胞， 加细胞裂解液［Lysis Buffer， 20 mmol/L TrisHCl (pH7.5)， 150 mmol/L NaCl， 1 mmol/L Na2EDTA， 1 mmol/L EGTA， 10 mL/L Triton， 10 mL/L NP40， 2.5 mmol/L Sodium pyrophosphate， 1 mmol/L βglycerophosphate， 1 mmol/L Leupeptin， 1 mmol/L PMSF］， 冰浴30 min后于10 000 r/min离心3 min， 收集离心上清液， 于蛋白分析仪（Beckman DU640）上测定各样品蛋白含量（Bradford比色法， 美国Pierce公司）。取40 μg蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后， 进行100 g/L SDSPAGE， 并转移至硝酸纤维素膜（0.45 μm， ImmobilonP， Millipore）， 于封闭液（含50 g/L脱脂奶粉， 20 g/L BSA， 0.5 mL/L Tween20的PBS）室温封闭2 h， 分别加入抗人IL18、 抗人IL18Rα（1∶500， R&&D System）或抗人Actin抗体（1∶2 000， Santa Cruz）， 于杂交炉（Hybaid）中室温滚动反应2 h; 洗膜5 min×3次， 加相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗(1∶5 000， Santa Cruz)， 室温反应2 h; 充分洗膜后作ECL化学发光（SuperSignal West Dura Kit， Pierce）， X片（Kodak）曝光显影。

　　1.6 荧光定量RTPCR检测 收集各组滑膜细胞， 用TRIzol（美国Gibco公司）常规提取总RNA， 溶于50 μL DEPC处理水， 经核酸蛋白紫外分析仪（Beckman DU640）检测， 260/280比值为1.75～1.80。取1 μg总RNA于42℃逆转录（SuperScript II Reverse Transcriptase， Invitrogen）50 min后， 以β肌动蛋白（βactin）作为内对照， 进行荧光定量PCR（LightCycler FastStart SYBR Green I Master， Roche）检测IL18及IL18R mRNA表达水平。IL18引物（扩增产物480 bp）上游: 5′TTC GGG AAG AGG AAA GGA AC3′， 下游: 5′AAG GAT ACA AAA AGT GAC AT3′; IL18R引物（扩增产物419 bp）上游: 5′CCC AAC GAT AAA GAA GAA CGC C3′， 下游: 5′TGT CTG TGC CTC CCG TGC TGG C3′; βactin引物（扩增产物619 bp）上游: 5′CGC TGC GCT GGT CGT CGA CA3′， 下游: 5′GTC ACG CAC GAT TTC CCG CT3′。每个LightCycler PCR（15 μL）反应体系为: 1.5 μL LightCycler FastStart DNA Master Mix， 1.8 μL MgCl2（25 mmol/L）， 0.4 μL of each primer（10 μmol/L）， 2 μL经10倍稀释的cDNA， 9.3 μL h3O。PCR程序为95℃预变性10 min; 94℃变性10 s， 65℃复性15 s， 72℃延伸15 s， 扩增50个循环; PCR产物95℃变性1 min后迅速降温至55℃维持30 s， 缓慢升温（0.1℃ steps）至95℃， 收集荧光信号， 熔解曲线分析。结果以目的基因与相应的βactin比值表示。反应结束后， 取5 μL PCR产物作琼脂糖凝胶（15 g/L）电泳检测。

　　1.7 NFκB p65活性检测 用NFκB p65转录因子试剂盒(Active Motif， CA， USA)检测NFκB活性， 细胞蛋白抽提液 (5 μg/孔) 加入包被有NFκB 特异性寡核苷酸探针的96孔板中， 再依次加入能特异性结合转录因子的一抗和相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗进行孵育， 每步均洗板3次， 最后加入TMB底物液显色， 显色终止后于全自动酶标仪(Biotek ELX800)读取A450值。以 A450值表示NFκB活性。

　　1.8 统计学分析 结果以x±s表示， 各组间比较采用非配对资料的t检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

　　2.1 培养上清液IL18的水平及生物活性 PMA能明显诱导RASF IL18的表达， 而TP（≥50 μg/L）能显著抑制PMA刺激的RASF IL18的表达及其生物活性（表1）。表1 培养上清液IL18的水平及生物活性

　　2.2 TP抑制RASF IL18及IL18Rα的表达 Western blot结果（图1）显示， TP能不同程度地抑制PMA刺激的RASF IL18及其受体的蛋白表达， 抑制作用与TP浓度呈剂量相关。结果也显示， TP对IL18（≥50 μg/L）的抑制作用明显高于对IL18Rα（100 μg/L）的抑制作用。

　　2.3 TP抑制RASF IL18及IL18R的基因表达 用LightCycler 荧光定量PCR检测， 50 μg/L的TP即能明显抑制PMA诱导的RASF IL18 mRNA的表达， 而对IL18R基因表达的抑制作用则为100 μg/L（图2）。

　　2.4 TP 抑制RASF NFκB活性 NFκB 活性检测结果(图3)显示， TP 能有效抑制PMA刺激的 RASF NFκB活性， 其抑制效应和TP浓度正相关。

　　3 讨论

　　IL18在RA的发生和进展中起到关键的作用。IL18R表达在Th1细胞表面。IL18在Th1型免疫反应中诱导巨噬细胞分泌单核因子。 活化的巨噬细胞诱导局部的炎症反应， 产生 IL1、 TNFα和 MMPs。此外， 在RA患者IL18促使NO生成， 介导IFNγ的分泌， 还能促使血管增生［6］。成熟的IL18的活性和IL1密切相关。 IL18诱导 Th1型 淋巴细胞分泌 IFNγ和表达Fas/FasL， 促使 T 细胞 和NK细胞增殖。 IL18的生物学活性评价可通过检测 IFNγ 分泌。 研究发现 TP 有效抑制 IL18 和 IFNγ表达。在炎症反应和自身免疫性疾病中IFNγ 是一个主要的促炎因子。 IFNγ 通过诱导最初的 iNOS 和 之后NO产生而发挥作用。 TP减少了IL18的表达， 从而间接减少 IFNγ分泌 和 NO生成。

　　过度表达的IL18 诱导 Th1分泌大量IFNγ 和促使 Th1的分化， 打破了 Th1/Th3的平衡， 使RA恶性进展。 研究表明TP能抑制 IL18 表达， 维持Th1/Th3的平衡从而减轻RA的炎症状态。

　　研究显示TP对IL18和IL18R的抑制程度可能有所不同。Western blot和荧光定量 RTPCR 显示TP在蛋白水平和基因水平都能抑制IL18和IL18R的表达， 而TP对IL18的抑制效应更为明显。这些结果提示IL18可能是TP主要靶点。当IL18表达受到抑制的时候， IL18R反馈性的减少。

　　NFκB 是一个调节炎症介质表达的重要的转录因子。Han等［7］报道在RA患者 NFκB的表达增加， 活性增强。活化的 NFκB使许多基因转录增强， 包括IL1β、 TNFα、 IL6、 IL8、 GMCSF和COX2。而且， 过度表达的炎性因子如TNFα和 IL1β又诱导NFκB 的活化。这就形成了一个正反馈系统， 促进RA病情进展［8］。研究结果显示TP能显著抑制NFκB的活性， 并且呈剂量相关性。 所以NFκB 通路可以作为治疗RA的又一个靶点。IL18的信号转导主要通过NFκB信号通路。 IL18通过依靠JNK、 p38 MAPK、 PI3K和NFκB促进了关节滑膜成纤维细胞产生血管生成因子。IL18主要通过IL18R复合物起作用。 IL18R复合物由一条结合链IL18Rα和一条信号链组成。 IL18Rα是IL1受体家族成员， 是IL1受体相关蛋白(IL1Rrp)。 IL18R复合物招募IL1R激活激酶(IRAK)和TNF 受体相关因子6 (TRAF6)， 使 NFκB诱导激酶磷酸化， 最后导致NFκB的活化。Sylvester等［9］报道TP通过抑制NFκB的活性抑制关节软骨细胞MMP基因的表达。TP能够有效的抑制PMA 作用的RASF表达IL18、 IL18R和 NFκB， 所以推测 TP 对 IL18和IL18R的抑制效应同NFκB活性相关。

　　总之， TP在蛋白和基因两个水平抑制IL18和IL18R的表达， 从而抑制 NFκB 的活性， 使IFNγ、 NO和血管生成减少。TP也能维持RA患者Th1/Th3的平衡。已经有报道IL18单克隆抗体、 可溶性IL18受体(IL18R)和IL18结合蛋白 (IL18BP)用于RA的治疗。因此， TP 和这些IL18抑制分子共同作用抑制IL18和IL18R将有望应用于临床RA的治疗。

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