IL18对HK2细胞E钙黏蛋白表达的作用及其可能的胞内信号途径

　　　　作者：陈伟， 梁东， 姚翠微， 陶静莉， 陈孝文， 刘华锋

【摘要】 目的: 探讨白细胞介素18（IL18）是否通过核因子κB（NFκB）细胞内信号转导途径诱导近端肾小管上皮细胞转分化。方法: 实验分单纯IL18刺激组和SN50预孵育组， 单纯IL18 刺激组采用终浓度分别为0、 1、 10、 100 μg/L的IL18处理人肾小管上皮细胞株（HK2细胞）72 h， SN50预孵育组在此基础上预先应用终浓度为100 mg/L的NFκB特异性抑制剂 SN50预处理细胞0.5 h。然后应用免疫细胞化学法检测HK2细胞Ecadherin的表达百分数; 采用RTPCR法检测HK2细胞Ecadherin mRNA的表达。结果: NFκB特异性抑制剂SN50可拮抗IL18对HK2细胞Ecadherin mRNA和蛋白表达的抑制作用。结论: IL18可通过核因子κB（NFκB）细胞内信号转导途径诱导近端肾小管上皮细胞转分化。

【关键词】 上皮细胞间充质细胞转分化; IL18; NFκB; 肾小管上皮细胞

　　［Abstract］ AIM: To explore the effect of NFκB signaling pathway in interleukin18induced transdifferentiation in renal proximal tubular cells. METHODS: In IL18 stimulation groups， HK2 cells were challenged with different concentrations (0， 1， 10， 100 μg/L) of IL18 for 72 h; In SN50 preincubation groups， HK2 cells were incubated with 100 mg/L SN50 for 30 min before IL18 was added. At the end of the incubation， the expression of Ecadherin was determined by the combination of immunocytochemistry and RTPCR. RESULTS: Percentage of Ecadherin positive expression HK2 cells was decreased by IL18 in dosage dependant manner. Expression of Ecadherin mRNA in HK2 cells was also decreased by IL18 in dosage dependant manner. Recovered the mostly part of expression of Ecadherin was found after HK2 cells were pretreated with SN50. CONCLUSION: IL18induced transdifferentiation of RTECs is suppressed by blocking NFκB signaling pathway. IL18induced transdifferentiation of RTECs at least is partly via NFκB pathway.

　　［Keywords］renal tubular epithelial cells; interleukin(IL)18; nuclear factorκB; epithelialmesenchymal transdifferentiation

近年来已证实肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells， RTECs）间充质细胞转分化（epithelialmesenchymal transdifferentiation， EMT）在肾间质纤维化过程中发挥重要作用［1， 2］。稳定上皮细胞的物质主要是上皮细胞表型稳定物质如钙黏蛋白（Ecadherin）表达丧失和/或间充质细胞标志蛋白如α平滑肌肌动蛋白的表达是EMT的重要标志［3， 4］。 IL18是一多功能炎症因子， 我们前期研究发现: IL18可促进近曲小管上皮细胞转分化［5］， 但其细胞内通路尚不明确。有研究证实许多免疫炎症因子， 包括肿瘤坏死因子、 白细胞介素、 黏附分子、 单核细胞趋化因子1等均含有核因子κB（NFκB）的结合位点［6］; 另外有人研究发现阻断NFκB途径可以抑制EMT［7］。因此， 本研究通过观察NFκB特异性抑制剂SN50（可透过细胞膜， 抑制NFκB复合体核转位）对IL18所诱导HK2细胞Ecadherin表达的变化， 旨在进一步探讨IL18促进RTECs转分化的细胞内通路。

1 材料和方法

　　1.1 材料 人近端肾小管上皮细胞株（HK2）由上海第二医科大学瑞金医院肾科陈楠教授惠赠， IL18购自日本MBL公司， DMEM/F12培养基、 FCS购自美国Gibco公司， 多克隆鼠抗人Ecadherin一抗购自武汉博士德， 二抗试剂盒及DAB染色试剂盒均购自北京中杉公司， TRIzol、 ThermoScriptTM RTPCR System均购自美国Invitrogen公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养与鉴定 冻存的HK2细胞从液氮复苏后培养于含100 mL/L FCS、 1×108 U/L青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液中并进行传代培养， 培养条件为37℃、 50 mL/L CO2、 100%湿度。经相差显微镜、 扫描电镜以及免疫细胞化学（Cytokeratin18蛋白染色）鉴定证实为RTECs后用于实验。实验开始时将HK2细胞以1×109/L密度接种于内置盖玻片的6孔板中， 每孔1.5 mL， 用含100 mL/L FCS的DMEM/F12培养液培养24 h后， 换用无血清培养液同步24 h后用于实验。全部实验重复3次。

　　1.2.2 实验分组 （1）单纯IL18 刺激组: 只加入IL18， 使终浓度分别为0、 1、 10、 100 μg/L， 继续培养72 h后按期收集细胞; （2）SN50预孵育组: 在加入IL18之前预先加入终浓度为100 mg/L的SN50预孵育30 min， 其余实验过程同单纯IL18刺激组。

　　1.2.3 免疫细胞化学法检测HK2细胞Ecadherin的表达 采用免疫细胞化学二步法。按期收集细胞爬片， PBS冲洗3次后40 g/L多聚甲醛溶液固定细胞; 30 mL/L h3O2处理以阻断内源性过氧化酶活性; 抗原微波修复; 滴加一抗（1∶100多克隆鼠抗人Ecadherin抗体， ）， 4℃过夜; 次日PBS冲洗3次后滴加1∶250通用型lgG抗体HRP多聚体; PBS冲洗3次后滴加DAB显色剂， 最后苏木素复染。每次实验均用PBS代替一抗作空白对照。结果观察: 显微镜下观察细胞形态并计数随机视野1 000个细胞中Ecadherin阳性细胞百分数， 以胞膜及部分胞质染成棕黄色的细胞为阳性细胞， 计算阳性细胞百分率。

　　1.2.4 RTPCR法检测HK2细胞Ecadherin mRNA的含量 用TRIzol一步法抽提细胞总RNA。继之应用ThermoScriptTM RTPCR System进行cDNA第1链合成。PCR引物序列、 扩增条件及产物长度见表1， PCR扩增系统包括10×PCR 缓冲液2 μL， 25 mmol/L MgCl2 1.2μL， 10 mmol/L dNTP mix 0.4 μL， 5 mmol/L正链及反链引物各0.8 μL， Taq酶2 U， cDNA 1 μg， 最后加h3O至总体积20 μL。各取5 μL PCR产物行琼脂糖凝胶电泳， 应用UVP凝胶成像系统进行结果分析， 以目的基因（Ecadherin）扩增带积分吸光度与内参基因（GAPDH）扩增带积分吸光度之比值表示Ecadherin mRNA的相对表达量。表1 PCR特异性引物及扩增条件

　　1.2.5 统计学分析 实验结果用x±s表示， 数据处理采用SPSS13.0统计软件进行统计分析， 组内比较采用单因素方差分析; 组间比较采用配对t检验。

2 结果

　　2.1 SN50可拮抗IL18诱导的HK2细胞Ecadherin表达下调 免疫组化结果显示， 正常对照组HK2细胞呈多边形铺路石状， 且胞膜及胞质内强烈表达Ecadherin， 单纯IL18组HK2细胞多呈梭形、 长条状， Ecadherin的表达随IL18刺激浓度的增大而减少， 经SN50预处理的HK2细胞形态由梭形恢复为多边形铺路石状， Ecadherin表达较单纯IL18组有所上升（表2）。表2 SN50对IL18诱导HK2细胞Ecadherin表达的影响

　　2.2 SN50可拮抗IL18诱导的HK2细胞Ecadherin mRNA表达下调 RTPCR结果显示， 单纯IL18组HK2细胞Ecadherin mRNA的表达随着IL18浓度的增加相应减少， SN50预孵育组HK2细胞Ecadherin mRNA的表达较单纯IL18组增加（表3， 图1）。表3 SN50对IL18诱导的HK2细胞Ecadherin mRNA表达的影响

3 讨论

　　IL18是一促炎细胞因子， 我们与国内外同行学者的研究均已经证实IL18可促进多种各种急、 慢性肾损伤过程［5， 8］。RTECs表型转化是肾间质纤维化重要的病理生理基础之一。近年来， RTECs转分化的细胞内信号转导机制也已备受关注。NFκB是由P65和P50蛋白亚基组成的二聚体， 其主要生物功能之一就是通过调控一系列重要基因的表达参与免疫和炎症反应， 已有证据显示NFκB在EMT中起重要介导作用， IL18是否通过NFκB途径促进RTECs EMT尚未见文献报道。

　　本研究结果显示， IL18呈剂量依赖性抑制HK2细胞Ecadherin基因及蛋白的表达， 而NFκB特异性抑制剂可显著逆转此作用， 且SN50作用后HK2细胞形态由梭形长条状恢复为多边形铺路石状， 表明IL18可能是通过NFκB途径抑制Ecadherin表达的， 而该途径被阻断则显示出一定程度上EMT的逆转。我们曾报道NFκB选择性抑制剂PDTC对单侧肾梗阻模型肾纤维化具有一定的治疗作用［9］， 而此研究从体外角度进一步证实阻断NFκB通路对肾纤维化具有治疗价值。下一步的研究是寻找一种无生物毒性且对某些人类肾纤维化有确切治疗作用的NFκB选择性抑制剂。

参考文献

［1］ Nangaku M. Chronic hypoxia and tubulointerstitial injury: A final common pathway to endstage renal failure［J］. J Am Soc Nephrol， 2006， 17(1): 17-25.

［2］ Masayuki I， David P， Theodore M， et al. Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis［J］. Clin Invest， 2002， 110(3): 341-350.

［3］ Lan HY. Tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation mechanisms in proximal tubule cells［J］. Curr Opin Nephrol Hypertens， 2003， 12(1): 25-29.

［4］ Yang J， Liu Y. Dissection of key events in tubular epithelial to myofibroblast transition and its implications in renal interstitial fibrosis［J］. Am J Pathol， 2001， 159(4): 1465-1475.

［5］ Liang D， Liu HF， Yao CW， et al. Effects of interleukin 18 on injury and activation of human proximal tubular epithelial cells［J］. Nephrology， 2007， 12(1): 53-61.

［6］ Albert S， Balelwin Jr. The NFκB and IκB proteins: new discoveries and insights［J］. Annu Rev Immunol， 1996， 14(2): 649-681.

［7］ Ghosh S， May MJ， Kopp EB. NFκB and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune response［J］. Annu Rev Immunol， 1998， 16(2): 225-260.

［8］ 王晓非， 刘海娜， 蒋 莉， 等. 狼疮肾炎患者血中巨噬细胞衍生趋化因子和IL18水平的变化及意义［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(6): 767-768.

［9］ 陶静莉， 梁 东， 刘华锋， 等. 特异性NFκB抑制剂对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的治疗作用［J］. 中国药理学通报， 2008， 24(4): 539-542.