IL12调节蛋白酶激活受体在肥大细胞的表达

　　　　作者：张慧云 林青， 林丽艳， 张忠芳， 杨海伟 何韶衡

【摘要】 目的: 探讨IL12对肥大细胞蛋白酶激活受体（PARs）表达的影响。方法: 不同浓度IL12刺激肥大细胞后， 在不同时间点， 用实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRTPCR）和流式细胞术（FCM）， 在mRNA水平和蛋白水平检测PAR1、 PAR2、 PAR3和PAR4在肥大细胞P815表面和胞内的表达情况。结果: IL12下调肥大细胞膜表面PAR2蛋白的表达， 上调肥大细胞膜表面和胞质内PAR4蛋白的表达， IL12抗体的应用可阻断IL12对肥大细胞PARs蛋白表达的影响; IL12上调肥大细胞PAR1、 3、 4 mRNA的表达， 下调PAR2 mRNA的表达。结论: IL12在过敏性炎症反应中的调节作用可能与IL12调节肥大细胞PARs表达有关。

【关键词】 蛋白酶激活受体; 肥大细胞; 实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT PCR）; 流式细胞术（FCM）

蛋白酶激活受体（protease activated receptors 或proteinase activated receptors， PARs）是G蛋白偶联受体（Gprotein coupled receptor， GPCR）家族中的新成员， 目前在人和小鼠体内共发现了4种PARs， 即PAR1、 PAR2、 PAR3和PAR4， 它们的基因序列于1991、 1994、 1997和1998年被先后克隆出来［1］。有关的研究显示PARs是哮喘、 肺水肿和气道高反应性疾病病理生理过程中的重要效应受体， 一些病理情况伴随着PARs表达的改变: 过敏性鼻炎患者鼻黏膜PAR2表达增强 ， 哮喘患者气道PAR2表达增强， 小鼠气道病毒感染时PAR1和PAR2表达上调。尽管有研究显示扁桃体、 皮肤、 和结肠来源的肥大细胞表达PAR2， 然而仍缺乏PAR对肥大细胞功能影响方面的研究。抑制Th3细胞克隆、 调节Th1细胞分化， 调节先天免疫反应、 决定后天免疫反应的类型和持续时间的IL12亦与过敏反应的发生有关［2， 3］。因此我们首先探讨炎症性细胞因子IL12对肥大细胞PAR表达的调节作用为进一步探讨PAR表达对肥大细胞功能影响的研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 小鼠肥大细胞株P815（美国标准培养物保藏中心， ATCC）。青链霉素、 PBS（10×）、 牛血清白蛋白（BSA， V级）和多聚甲醛均购自Sigma公司， DMEM、 胎牛血清和TSTIM购自HyClone公司， TRIzol Reagent购自Invitrogen公司， ExScriptTM RT试剂盒、 SYBR Premix Ex TaqTM(perfect real time)和PCR Marker购自TaKaRa公司， IL12和抗IL12单克隆抗体（mAb）购自R&&D公司， FITC标记的羊抗鼠PAR2 mAb、 兔抗鼠PAR1 mAb、 兔抗鼠PAR3多克隆抗体、 兔抗鼠PAR4多克隆抗体购自Santa Cruz公司， FITC标记的羊抗兔多克隆抗体购自BD Pharmingen公司， 琼脂粉购自BBI公司， SYBR Green I核酸凝胶染料购自BMA公司。细胞培养箱购自德国Heraeus， 生物安全柜HFsafe 1200购自Heal Force公司， 台式高速冷冻离心机centrifuge 54158、 58108购自eppendorf公司， 紫外分光光度计Smart Spec 3000 和电泳仪购自BIORAD公司， PCR扩增仪PTC200购自MJ Research公司， 凝胶成像分析系统购自SYNGENE公司， FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司， ABI PRISM 7700型荧光定量PCR扩增仪购自ABIPE公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肥大细胞培养与激发 P815细胞接种于75 cm2培养瓶(Falcon)内， 用ATCC完全培养液（DMEM内含4 mmol/L的L谷氨酰胺、 1.5 g/L碳酸氢钠、 4.5 g/L葡萄糖、 100 mg/L FBS、 100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素）于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。以上细胞经无血清培养6 h后用不同浓度的IL12（0.1～100 μg/L）及IL12阻断抗体（10、 30 mg/L）处理细胞， 分别于2 h、 6 h或16 h终止反应， 4℃条件下450 g离心10 min后收集细胞重悬用于流式细胞术(FCM)分析和实时定量PCR分析。

　　1.2.2 FCM分析 上述激发后细胞经20 g/L多聚甲醛固定30 min后PBS洗涤后重旋。PAR1， PAR3和PAR4的标记: 加兔抗鼠PAR1 mAb或兔抗鼠PAR3、 PAR4多克隆抗体以及同型对照2 mg/L， 37℃孵育1 h。用含10 g/L BSA的PBS洗涤2次后加FITC标记的羊抗兔多克隆抗体1 mg/L， 37℃孵育1 h。PAR2的标记: 加FITC标记的羊抗鼠PAR2 mAb以及同型对照4 mg/L， 37℃孵育1 h。用含10 g/L BSA的PBS洗涤2次后， PBS重悬细胞， 以FCM检测肥大细胞PARs的表达情况。

　　1.2.3 实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRTPCR） 采用TRIzol试剂提取激发后细胞的总RNA， 按照TaKaRa ExScriptTM RT 试剂盒说明进行cDNA合成。PAR1， PAR2， PAR3， PAR4和βactin的特异性引物均由上海英竣生物技术有限公司设计合成， PAR1 F: 5′GTTGATCGTTTCCACGGTCT3′， PAR1 R: 5′ACGCAGAGGAGGTAAGCAAA3′; PAR2 F: 5′CACCTGGCAAGAAGGCTAAG3′， PAR2 R: 5′CCCAGGGTTACTGACGCTAA3′; PAR3 F: 5′TCAATGGCAACAACTGGGTA3′， PAR3 R: 5′AAAACCATGACCCACACCAT3′; PAR4 F: 5′GCAGACCTTCCGATTAGCTG3′， PAR4 R: 5′AGGGCTCGGGTTTGAATAGT3′; βactin F: 5′GCTACAGCTTCACCACCACAG3′， βactin R: 5′GGTCTTTACGGATGTCAACGTC3′。将待测cDNA 或倍比稀释的标准品加入到25 μL反应体系中， 同时设立无模板对照和待测样品βactin内参对照。根据SYBR Premix Ex TaqTM(perfect real time)试剂盒说明在ABI PRISM 7700型荧光定量PCR扩增仪(ABIPE公司)操作。每个反应体系包括2×SYBR green Master Mix 12.5　　 μL， 300 nmol/L的引物， cDNA 或质粒DNA的10倍稀释液10 μL， 双蒸水加至总体积为25 μL。PCR扩增条件为95℃ 2 min， 95℃ 30 s、 60℃ 30 s和72℃ 30 s 40个循环。标准曲线用10倍系列稀释（101～108个拷贝数）的上述引物序列特异性质粒DNA作为反应模板扩增获得。根据标准曲线获得的样品中PAR1， PAR2， PAR3 和PAR4基因表达拷贝数以内参βactin拷贝数校正。每样做复孔。

　　1.2.4 统计学分析 全部数据均采用SPSS13.0（SPSS Inc）软件分析， 数据以平均数±标准误（mean±SEM）或平均数±标准差（x±s）表示。统计学方法为单因素方差分析或Student’s t检验， P&<0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

　　2.1 IL12调节肥大细胞PARs蛋白表达 FCM结果显示， 浓度为1 μg/L， 10 μg/L 和100 μg/L的IL12作用于肥大细胞2 h， 6 h和16 h， 均下调肥大细胞表面PAR2表达。荧光强度分析显示IL12下调PAR2表达， 其平均荧光强度下降幅度可高达约38%， 应用10 mg/L和30 mg/L IL12抗体可阻断IL12下调PAR2表达的作用(表1)。上述浓度的IL12作用于肥大细胞2 h， 6 h和16 h后对肥大细胞胞质内PAR2表达无明显影响（结果未显示）。表1 FCM分析IL12对肥大细胞P815膜表面PAR2表达的影响

　　浓度为1 μg/L、 10 μg/L和100 μg/L的IL12作用于肥大细胞2 h、 6 h和16 h的结果显示IL12以浓度依赖的方式上调肥大细胞P815膜表面和胞质内PAR4的表达。荧光强度分析显示IL12上调肥大细胞膜表面（表2）和胞质内（表3）PAR4表达， 其平均荧光强度上升幅度可高达对照组的1.6倍（表2）和1.5倍（表3）， IL12作用2 h即显示出上调肥大细胞PAR4表达的作用。 应用10 mg/L 和 30 mg/L 的IL12抗体可完全阻断IL12上调肥大细胞膜表面(表2)和胞质内(表3)PAR4表达的作用。

　　上述浓度的IL12作用于肥大细胞2 h、 6 h和16 h 后对肥大细胞膜表面和胞质内PAR1和PAR3蛋白表达无明显影响（结果未显示）。表2 FCM分析IL12对肥大细胞P815膜表面PAR4表达的影响表3 FCM分析IL12对肥大细胞胞质内PAR4表达的影响

　　2.2 IL12调节肥大细胞PARs mRNA的表达 实时定量PCR结果显示， 浓度为 0.1 μg/L， 1 μg/L和 10 μg/L的IL12作用于肥大细胞6 h， 上调其PAR1 mRNA表达高达对照组4.1倍（表4）。而10 μg/L和 100 μg/L的IL12作用于肥大细胞6 h 后， P815细胞PAR2 mRNA表达下降幅度高达对照组66%（表5）。浓度为0.1 μg/L， 1 μg/L， 10 μg/L和100 μg/L的IL12作用于肥大细胞2 h、 6 h 后上调PAR3 mRNA表达， 6 h 结果显示上调程度高达对照组9.3倍（表6）。浓度为0.1 μg/L， 1 μg/L， 10 μg/L和100 μg/L的IL12作用于肥大细胞2 h、 6 h 表4 实时定量PCR分析IL12对肥大细胞PAR1 mRNA表达的影响

　　刺激物PAR1 mRNA copies/βactin mRNA copies2 h6 h16 h基础培养液8.1±0.19.0±0.6 8.5±2.3IL12 0.1 μg/L8.2±1.336.4±11.7a11.3±2.5IL12 1.0 μg/L7.6±1.136.5±14.3a7.0±0.95IL12 10 μg/L6.8±1.323.8±5.8a5.5±3.3IL12 100 μg/L9.3±0.814.2±2.48.7±1.4

　　PAR: 蛋白酶激活受体. aP＜0.05 vs基础培养液.表5 实时定量PCR分析IL12对肥大细胞PAR2 mRNA表达的影响表6 实时定量PCR分析IL12对肥大细胞PAR3 mRNA表达的影响表7 实时定量PCR分析IL12对肥大细胞PAR4 mRNA表达的影响

3 讨论

　　PARs是丝氨酸蛋白酶（serine proteases）受体， 其中PAR1是凝血酶和胰蛋白酶的受体， PAR2是胰蛋白酶、 类胰蛋白酶和弹性蛋白酶的受体， PAR3和PAR4是凝血酶的受体［1， 4］。细胞内经转录、 翻译新合成的PAR通过其所包含的126个残基的信号肽转运到细胞膜表面， 表达于细胞膜上的PAR因静息和激活状态的不同而经历不同的内吞过程［5］: 在静息情况下， 表达于膜表面PAR经结构内吞储存于细胞内池（需要时再释放、 转运到细胞膜表面）; 表达于膜表面的PAR一旦被蛋白酶或激活肽激活即启动另一种内吞过程细胞内溶酶体内吞进而降解激活的PAR而使之失去活性， 所以PAR失活后其反应性的恢复有赖于PAR的重新合成或细胞内池募集PAR的动员释放。因此mRNA水平和膜表面及胞质内蛋白水平的PARs表达受IL12调节的情况都成为本实验探讨的对象。

　　本实验的结果显示IL12下调肥大细胞膜表面PAR2蛋白mRNA的表达。由于的激活膜表面PAR2可以引起肥大细胞脱颗粒［6］， 此结果提示此促进Th0向Th1分化的细胞因子IL12可能通过调节肥大细胞PAR2的表达参与调节过敏性炎症反应。已有的研究发现Th3细胞因子IL4通过显著下调巨噬细胞膜表面PAR2蛋白和mRNA的表达来调节巨噬细胞在炎症和动脉粥样硬化形成中的作用［7］。 这些研究结果提示Th1和Th3细胞因子都可以通过调节炎症细胞PAR2表达来调节炎症过程。另有研究发现其他类型的细胞因子如TGFβ1， IL1β和TNFα亦具有调节炎症状态下细胞PAR2 表达的功能［8］。

　　本实验结果亦显示IL12上调肥大细胞PAR4蛋白和mRNA表达。既然PAR4是凝血酶的受体， 而凝血酶已经被证实积极参与炎症过程， 由此不难推测IL12亦可能通过上调肥大细胞PAR4 表达来参与和调节炎症过程。相关研究的发现即前炎症细胞因子IL1α 和TNFα［9］的刺激可选择性增强离体人冠状动脉PAR4 mRNA表达并伴随血管反应性增强。

　　IL12对肥大细胞PAR1和PAR3的上调作用仅发生在mRNA水平而不表现在蛋白水平的实验结果与其他细胞因子调节PAR1和PAR3表达的研究结果不尽相同， 其他细胞因子对PAR1， PAR3表达的调节作用大多表现在蛋白水平或蛋白和mRNA水平［7， 10， 11］: TNFα和IL4可以下调人内皮细胞和人巨噬细胞PAR1蛋白和mRNA表达; PDGF， GMCSF 和MCSF 可上调人巨噬细胞PAR1和PAR3 蛋白和mRNA表达; TNFα和IL1β 有抑制人骨骼肌细胞PAR1蛋白表达下调的作用; TGFβ1 增强人和大鼠血管平滑肌细胞 PAR1 蛋白表达的作用。

　　多种理化刺激和病理过程能上调或下调PARs的表达情况［5］， 本研究首次证实IL12能够调节肥大细胞PARs的表达。而本实验的研究结果和大部分相关研究结果均显示各种因素引起的蛋白水平的PAR表达改变通常伴有其mRNA水平的变化， 也就是说在病理情况下转录水平的调节对PARs表达的调节发挥了至关重要的作用。尽管转录翻译、 膜表面转运和溶酶体降解都与PAR表达的调节密切相关， 然而仍期待深入探究各种因素包括IL12调节PARs表达的确切机制。

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