氧化低密度脂蛋白刺激人冠状动脉内皮细胞可诱导共刺激分子配体的表达

　　　　作者：徐琳， 李志梁， 朱肖星， 马骏， 洪长江， 何建新， 向定成， 潘春梅， 邱健

【摘要】 目的: 探讨氧化低密度脂蛋白(oxLDL)对人冠状动脉内皮细胞表达可诱导共刺激分子配体(ICOSL)的影响。方法: 以人冠状动脉内皮细胞为研究对象， 通过间接免疫荧光、 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和Western blot等方法， 观察ICOSL在人冠状动脉内皮细胞的表达及oxLDL的干预作用。结果: 对照组和oxLDL刺激组ICOSL mRNA的平均光密度OD值分别为0.071±0.035和0.186±0.044(n=6)， ICOSL Western blot吸光度A值分别为10.88±1.53和16.03±4.08(n=6)， oxLDL(100 mg/L)可增加ICOSL在人冠状动脉内皮细胞中mRNA和蛋白的表达， 并具有统计学意义(P&<0.05)。结论: oxLDL可上调人冠状动脉内皮细胞表达ICOSL。

【关键词】 ICOSL; oxLDL; 冠状动脉内皮细胞; 动脉粥样硬化; 免疫

　　[Abstract] AIM: To study the expression of inducible costimulator ligand(ICOSL) on human coronary artery endothelial cells(HCAEC) and its being interferentialed by oxidized low density lipoprotein(oxLDL). METHODS: ICOSL expression levels were determined by the fluorescence， reverse transcription PCR (RTPCR) and Western blot， respectively. RESULTS: The ICOSL mRNA OD values of control and 100 mg/L oxLDL group was 0.071±0.035 and 0.186±0.044， respectively. The Western blot A values of control and 100 mg/L oxLDL group was 10.88±1.53 and 16.03±4.08， respectively. oxLDL increased expression of ICOSL mRNA and protein(P&<0.05). CONCLUSION: ICOSL can express on the HCAEC. oxLDL can upregulate the expression of ICOSL.

　　[Keywords]inducible costimulator ligand; oxidized low density lipoprotein; human coronary artery endothelial cells; atherosclerosis; immune

动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)作为一个慢性炎症反应的理论已被广泛接受， 新近研究发现， 在AS发生发展的整个进程中都有免疫反应的参与， 通过免疫调节治疗AS正在成为人们关注的热点[1]。可诱导共刺激分子配体(inducible costimulator ligand， ICOSL)是新近发现的B7家族成员， 主要在活化的B细胞、 肥大细胞、 部分活化的单核细胞、 成纤维细胞、 肾小管上皮细胞和造血母细胞上表达， ICOSLICOS这一对共刺激信号在抗原呈递和自身免疫性疾病中起重要作用， 并参与了AS的进程[2]。冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells， HCAEC)既是内分泌组织又是激素反应组织， 与血管壁炎症、 动脉硬化的发生和发展密切相关。氧化低密度脂蛋白(oxidationlow density lipoprotein， oxLDL)可分泌致AS的细胞因子和炎症因子， 还是AS细胞免疫反应中最主要的自身抗原[3]。本研究中以HCAEC为研究对象， 观察公认的具有致AS作用的oxLDL对ICOSL表达的影响， 为AS的免疫学发病机制提供新的思路和实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 RPMI1640培养基(Gibco， USA)， HCAECc12221细胞株(Science Cell公司)， 羊抗人ICOSL mAb(Santa Cruz Biotechnology公司)， oxLDL(北京协和三友科技有限公司)。ICOSL和GAPDH(作为内参)引物由英俊公司设计合成， TRIgol试剂盒和RTPCR试剂盒分别为BilFlux和TaKaRa公司产品， 其余试剂为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人冠状动脉内皮细胞的培养与鉴定 复苏HCAEC， 调节细胞密度为3×109/L， 用含100 mL/L胎牛血清RPMI1640培养液培养， 接种于24孔培养板， 细胞长至70%～80%时换用无血清培养液24 h， 换液后即可用于实验。内皮细胞鉴定采用Ⅷ因子相关抗原， 按SP免疫组化试剂盒说明书操作。倒置相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石状生长， 有接触抑制现象。胞质着色者为阳性细胞。细胞纯度&>99%， 台盼蓝染色细胞活力大于97%。

　　1.2.2 实验分组 实验分为2组， 空白对照组和100 mg/L oxLDL组。

　　1.2.3 间接免疫荧光检测ICOSL的表达 制备HCAEC爬片， 固定液(含20 g/L多聚甲醛和1 mL/L TRIton X100)室温固定30 min， PBS洗2次， 以1∶50 PBS(pH7.2)稀释的正常羊血清封闭20 min， PBS洗3次， 每次1～2 min， 滴加0.1 mol/L PBS(pH 7.2)1∶100稀释的ICOSL的羊单克隆抗体， 37℃孵育30 min， PBS洗5次， 每次2 min， 加入FITC标记的兔抗羊二抗， 避光， 4℃下孵育30 min， PBS洗3次， 荧光显微镜下观察， 摄影。

　　1.2.4 RTPCR检测人冠状动脉内皮细胞ICOSL及GADPH看家基因的表达 以TRIzol试剂盒抽提HCAEC总RNA， DU530紫外分光光度仪(Beckman公司)测定样本总RNA含量。采用一步法RTPCR试剂盒进行ICOSL基因和GADPH看家基因表达检测， 反应体系和条件按试剂盒说明书进行。用于ICOSL基因RTPCR的引物序列为: 5′AGGAAGTCAGAGCGATGGTAG3′(上游引物序列)， 5′AGGCTGTTGTCCGTCTTATTG3′(下游引物序列)， 目的片段469 bp。用于GADPH看家基因RTPCR的引物序列为: 5′CGACCA CTTTGTCAAGCTCA3′(上游引物序列)， 5′AGGGTCTACATGGCAACTG3′(下游引物序列)， 目的片段240 bp。反应结束后， 取反应产物10 μL进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色， UVP型凝胶图像分析系统摄图， 并分析各组目的基因及GAPDH基因平均光密度值(OD)， 以二者的比值代表ICOSL的表达。以PCR产物为模板， 用ICOSL特异引物作为测序引物置ABI 3730型测序仪进行序列测定， 并将所得的测序结果与GenBank数据库进行BLAST同源性比较。ICOSL序列比较使用NCBI网站提供的BLAST程序。

　　1.2.5 Western blot检测人冠状动脉内皮细胞ICOSL蛋白的表达 收获细胞2×1010/L， PBS洗2次， 提取膜蛋白后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上， 在PBST洗涤缓冲液中轻轻摇动， 洗涤15 min。加入一抗， 室温孵育1 h， PBST洗膜3次。加入二抗， 孵育1 h， PBST洗膜3次。ECL液染色， 曝光， 化学发光凝胶成像分析系统成像， 分析各组目的条带及GAPDH的吸光度值(A)， 以二者的比值代表ICOSL蛋白表达。

　　1.2.6 统计学分析 所有实验结果以x±s表示， 两因素比较采用析因方差分析， 组间差异比较采用oneway ANOVA， 多重比较采用LSD(least significant digit)法， 所有统计学处理均采用SPSS 11.0统计软件进行分析。P&<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 ICOSL在人冠状动脉内皮细胞的表达 荧光显微镜下， 可见ICOSL表达于HCAEC表面， 呈绿色荧光。RTPCR结果显示可见ICOSL的mRNA扩增产物片段位于相当与Mr 469的位置， 与预期理论值大小一致(图1A)， 产物特异， 条带清晰， 经测序与基因库中人ICOSL基因序列完全吻合(结果略)。HCAEC表达ICOSL 蛋白水平， 通过Western blot显示ICOSL的蛋白约为Mr 70 000， 与理论值基本一致(图1B)。

　　2.2 oxLDL对HCAEC表达ICOSL mRNA和蛋白水平的影响 RTPCR及Western blot结果显示: oxLDL刺激组ICOSL的平均光密度OD值和吸光度A值均分别高于对照组， oxLDL可增加ICOSL在HCAEC中的mRNA和蛋白表达， 并具有统计学意义(P&<0.05， 图2、 3)。

　　.3 讨论

　　自20世纪80年代开始的一系列研究发现， 参与动脉粥样斑块形成过程的细胞和分子都是那些参与炎症反应的细胞和分子， 从而炎症理论得到了完善[4]。随着对AS研究的深入， 越来越多的证据显示AS不但具有慢性炎症的特征， 而且炎症反应的起始与持续都有先天性和获得性免疫应答的参与， 免疫介导在AS的发生机制和心血管触发事件发生中起重要作用， 其中T细胞活化是核心环节[4]。业已证实， T细胞活化依赖双重信号: 抗原刺激和共刺激信号， 且后者更为重要。ICOSL属于B7家族的新成员， 为一个由309个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白， 大小约63 000～72 000， 它与可诱导共刺激分子(inducible costimulator， ICOS)的基因突变或表达异常与某些炎症反应及自身免疫性疾病的发生密切相关。文献报道， ICOSLICOS这一对配体受体参与了AS的发生和发展[2]。本研究应用3种方法， 从定性到定量， 不仅在形态上(荧光显微镜下)， 而且在mRNA分子水平(RTPCR)和蛋白质水平(Western blot)证实ICOSL表达在HCAEC的细胞膜上， 这为研究ICOSICOSL共刺激途径与AS免疫病理过程的关系提供了直接依据和实验基础。血中oxLDL浓度升高是AS发展的独立的危险因素， oxLDL是炎症反应的强效诱导剂， 在破裂的斑块脂质核心中非常丰富。体外试验表明， oxLDL可损伤内皮细胞表面层糖萼， 导致血管内皮细胞黏附能力增强， 使血液中的单核细胞易于黏附于EC表面， 也可诱导血管内皮细胞及单核巨噬细胞表达黏附分子、 趋化性细胞因子、 促炎因子及其他炎症反应的中介物。近年来许多资料提示， oxLDL也是动脉粥样硬化细胞免疫反应中最重要的抗原， 经巨噬细胞表面的清道夫受体A、 CD36、 SRB1、 LOX1、 SRPSOX等途径吞噬降解的oxLDL片段被巨噬细胞以抗原肽MHC分子复合物方式呈递给邻近的T细胞和B细胞， 导致T、 B细胞的细胞因子分泌、 细胞毒性作用、 抗体产生等一系列特异性免疫反应[5]。此外， 抗oxLDL抗体存在于人体和实验性动脉粥样硬化斑块中， 说明oxLDL还能够诱发体液免疫反应。本实验中加入oxLDL刺激后， 分别运用RTPCR和Western blot检测ICOSL的表达量的变化， 结果显示ICOSL的mRNA平均光密度值和蛋白吸光度值比空白对照组明显增加， 文献报道oxLDL可使单核细胞和人脐静脉内皮细胞CD40及CD40L的表达上调[6]， 本研究的结果表明oxLDL能明显促进HCAEC表达ICOSL， 因此很可能是oxLDL致AS发生发展的又一关键环节。

　　总之， oxLDL及ICOSL参与了AS的免疫反应， 提示AS免疫机制可能通过B7家族共刺激分子实现， ICOSL能否作为反映AS炎症反应程度及AS病变活动的重要指标， 还需进一步研究。

参考文献

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