作者：郝贵杰， 沈锦玉， 徐 洋， 姚嘉贇， 潘晓艺
【摘要】 目的: 研制抗草鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体(mAb)并进行免疫学特性分析。方法: 制备草鱼免疫球蛋白IgM， 以其为抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠， 3～4次免疫后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合， 用ELISA法对杂交瘤进行筛选， 并鉴定mAb的生物学特性。结果: 各株阳性克隆经3次亚克隆后， 共获得5株抗草鱼IgM的mAbs， 分别命名为4B3、 2B11、 4D5、 3F2和4E6， 它们的细胞上清ELISA效价为1∶3 200～1∶6 400， 其中4D5的细胞上清及腹水效价分别为1∶6 400和1∶256 000， 经亚类鉴定结果表明5株mAb均为IgG1。交叉反应结果表明5株mAb均不与台湾甲鱼、 泰国甲鱼、 日本甲鱼和中华鳖的血清反应， 除mAb 4B3外， 其余4株均与草鱼、 青鱼、 鲢鱼、 鳊鱼和花鱼骨的血清有明显的交叉反应， 而与鲫鱼、 鳗鱼的血清只有微弱的反应。mAb 4B3只与草鱼和青鱼的血清有反应， 而与其他鱼类血清反应很弱。免疫印迹实验结果表明mAb 4D5能在变性条件下识别草鱼IgM的重链。ELISA检测mAb 4D5对草鱼IgM的敏感性达10 μg/L。结论: 制备的抗草鱼IgM mAb可用于草鱼免疫球蛋白的结构分析、 免疫应答水平监测和病原诊断等， 具有广阔的应用前景。
【关键词】 免疫球蛋白; 间接ELISA; 单克隆抗体; BALB/c小鼠
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是一种草食性鱼类， 饲养成本低， 养殖地域广， 具有悠久的养殖历史， 是我国四大家鱼之一， 其养殖对我国农业经济增长具有重要的意义[1]。但草鱼病害一直困扰该产业的发展， 尤其是草鱼出血病危害最为严重， 常引起草鱼鱼种及成鱼的大批死亡。要解决这些问题， 除了加强管理、 提高养殖技术外， 还必须重视其病原学、 免疫学等领域的研究， 将免疫预防手段引入到草鱼养殖业， 通过免疫手段有效增强鱼体主动防御能力， 减少疾病的发生机率[2]。然而对草鱼免疫学的研究还处于初始状态， 王欣欣等[3]克隆并分析了草鱼免疫球蛋白分子重链cDNA的一些特性。李亚南[4]进行了嗜水产气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白的分析， 得出草鱼的免疫球蛋白主要是IgM， 其单体的重链和轻链相对分子质量(Mr)分别为62 000和26 000。但未见到草鱼免疫球蛋白单克隆抗体(mAb)的研制和应用的报道。基于这种认识和生产上的需求， 我们开展了草鱼免疫球蛋白mAb的研究， 试图将mAb运用于草鱼Ig结构与功能的分析以及病原诊断学和免疫应答规律的研究。
1 材料和方法
1.1 材料 草鱼体重1 000～1 500 g， 购自湖州某农贸市场。8周龄雌性BALB/c小鼠及ICR小鼠购自浙江大学医学院实验动物中心。HT、 HAT及高糖型DMEM购自Sigma公司; 小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。L谷氨酰胺(LG)购自上海实生细胞生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自华美生物工程有限公司。融合用PEG4000购自Sigma公司， 邻苯二胺(OPD)购自华美公司， 其他生化试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 免疫原的制备 草鱼断尾取血， 室温放置2 h后， 放入4℃ 冰箱过夜， 使血清充分析出。次日收集血清， 4℃离心15 min以去除细胞和颗粒性物质。制备SephadexG200层析柱， 柱长70 cm， 直径1.6 cm。草鱼血清经50%饱合硫酸铵粗提， 透析并浓缩后约4 mL。用PBS(pH7.4)倍比稀释后， 经0.45 μm滤膜过滤后上样。用PBS洗脱， 自动采样器收集洗脱液， 并用紫外分光光度计跟踪测定洗脱液的蛋白浓度， 最先洗脱的蛋白即为IgM。将第一个洗脱峰接收的蛋白合并并测定浓度置于-20℃冰箱保存备用。
1.2.2 动物免疫 参照文献[5， 6]， 取适当抗原与弗氏完全佐剂按1∶1的比例混合乳化， 腹部皮下途径接种6～8周龄雌性BALB/c小鼠， 抗原蛋白量约为100 μg/只， 初次免疫后2周， 抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化， 同法免疫。以后免疫不再加佐剂， 分别在4周、 6周后各加强免疫1次， 融合前3 d腹腔及尾静脉途径再加强免疫1次。
1.2.3 细胞融合 细胞融合按常规方法[5， 6]， 取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0混合于融合管内， 1 000 r/min， 离心10 min， 弃去上清， 轻振融合管底， 使沉淀细胞松散均匀， 置37℃水浴中预热。然后在45 s内缓慢滴加预热的PEG4000溶液1 mL， 边加边轻转搅拌， 然后在90 s内缓慢加入不完全DMEM培养基， 终止融合。静置10 min后， 1 000 r/min， 离心10 min， 弃上清， 加入HAT培养基， 使细胞悬浮并混匀。加入适量饲养细胞分装至96孔细胞培养板， 放于60 mL/L CO2培养箱内培养。第4～5天各孔补加1滴HAT培养液， 第9～10天用HT培养液换出全部HAT培养液， 并可开始检测筛选。
1.2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 融合后待杂交瘤细胞长满孔底1/3～1/2时换液， 3～4 d后即可取细胞培养上清进行检测。用所提纯的草鱼IgM(用免疫小鼠阳性血清做方阵试验决定抗原包被浓度为10 mg/L)包被ELISA板， 4℃过夜包被， 用含0.5 mL/L Tween20的PBS(pH7.4)洗涤液满孔洗涤3～4次， 每次3～5 min。然后加200 μL含100 mL/L 小牛血清的PBS于37℃ 封闭3 h， 同上洗涤， 各孔加入待测的细胞培养上清100 μL， 阴性对照加PBS， 37℃孵育1 h， 同上洗涤; 每孔加入50 μL 1 000倍稀释的羊抗鼠IgGHRP(上海华美生物工程公司)， 37℃温育1 h， 同上洗涤; 每孔加入50 μL新鲜配置的OPDh3O2底物溶液， 于避光处反应10～l5 min， 然后每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液中止反应， 于492 nm下检测每孔A值， P/N&>2.1 者为阳性 。
1.2.5 阳性杂交瘤细胞系的建立与腹水制备 将阳性孔中的细胞扩大培养并及时冻存， 同时按有限稀释法进行亚克隆， 至阳性率为100%时， 即可定株。然后， 按Golding等[7]的方法进行腹水的制备。
1.2.6 mAb特性的鉴定 mAb细胞上清及腹水效价: 以10 mg/L的纯化草鱼免疫球蛋白包被酶标板， 4℃过夜， 封闭后加细胞上清和腹水抗体， 其中细胞上清稀释度为1∶200～1∶12 800， 腹水稀释度为1∶1 000～1∶1.024×106， 每孔100 μL， 其余步骤同1.2.4。mAb特异性的鉴定: 用间接ELISA的方法检测mAb与另外种类鱼、 鳖的IgM之间的交叉反应。收集草鱼、 青鱼、 鲢鱼、 鲫鱼、 鳊鱼、 鳗鲡、 花鱼骨以及台湾甲鱼、 泰国甲鱼、 中华鳖、 日本甲鱼的血清， 各种血清均用包被液以1∶1 000稀释后包被酶标板， 一抗为定株mAb的细胞上清进行交叉反应的测定[8]， 其余步骤同1.2.4。mAb灵敏度测定: 用包被液将提纯的草鱼IgM稀释成不同浓度悬液。从IgM含量为10 mg/L开始倍比稀释到2.25 μg/L， 分别取100 μL包被于酶标板各孔， 一抗为1 000倍稀释的单抗腹水， 其余步骤同1.2.4。
1.2.7 Werstern blot分析 SDSPAGE电泳采用不连续缓冲液垂直电泳系统， 浓缩胶为50 g/L， 分离胶为120 g/L。电泳及Western blot按
参考文献
[9]进行。一抗为1∶400稀释的mAb腹水， 二抗为 1∶500的羊抗鼠IgG酶标抗体。2 结果
2.1 mAb筛选及杂交瘤细胞系的建立 采用上述免疫和融合方法， 用间接ELISA试验检测细胞培养上清， 共获得了5株抗草鱼IgM的细胞株， 分别命名为4B3、 2B11、 4D5、 3F2和4E6， 杂交瘤细胞经3次亚克隆， 100%的检测孔保持了分泌抗草鱼IgM的能力， 经连续传代培养后， 依然能够稳定分泌抗体。
2.2 mAb的生物学特性 经间接ELISA法测定， 5株mAb的细胞培养上清ELISA效价为1∶3 200～1∶6 400， 其中4D5的细胞上清及腹水效价分别为1∶6 400和1∶256 000， 经亚类鉴定结果表明5株mAb均为IgG1。
2.3 mAb的特异性鉴定 按照1.2.6中方法进行交叉反应， 结果表明5株mAb均不与台湾甲鱼、 泰国甲鱼、 日本甲鱼和中华鳖的血清反应， 除mAb 4B3外， 其余4株均与草鱼、 青鱼、 鲢鱼、 鳊鱼和花鱼骨的血清有明显的交叉反应， 而与鲫鱼、 鳗鱼的血清只有微弱的反应。mAb 4B3只与草鱼和青鱼的血清有反应， 而与其他血类血清反应很弱。
2.4 mAb敏感性试验 用不同浓度的草鱼IgM抗原包被ELISA板， 间接ELISA 法测定mAb 4D5的敏感性， 结果表明该mAb腹水间接ELISA 方法的检测草鱼IgM灵敏度为10 μg/L。
2.5 Western blot 结果 按照1.2.7中方法测定mAb 4D5的特异性， 结果见图1。
3 讨论
由于mAb与抗原结合的特异性以及检测过程中逐级放大的特点， 可以精确定位和定量抗原， 是免疫学和血清学研究的重要工具， 被广泛用于ELISA、 FCM、 Western blot和免疫组化研究中， 其灵敏度可达到ng水平。鱼类免疫球蛋白(Ig)的mAb不仅可用于鱼类免疫细胞的鉴定、 发生和活性研究， 也可用于鱼类血清中Ig水平的检测， 监测病原感染或免疫接种过程中的免疫反应， 是鱼类免疫机理和鱼病免疫诊断研究的有力工具。
在草鱼免疫球蛋白mAb制备的过程中， 抗原的提纯是关键的一步。本试验采用硫酸铵粗提和凝胶层析方法提纯草鱼免疫球蛋白， 经提纯并透析所得草鱼IgM的浓度为4 g/L。SDSPAGE试验分析表明， 在纯化的Ig的H、 L链以外， 还存在一些蛋白条带， 这些蛋白带可能是因为盐析法及柱层析法进行蛋白纯化的过程较长， 产生了蛋白质降解。
取适当纯化蛋白进行小鼠免疫获得了较好的结果， 通过细胞融合及多次的克隆和筛选， 共获得了稳定分泌抗草鱼IgM mAb的杂交瘤细胞5株: 4B3、 2B11、 4D5、 3F2、 4E6。从Western blot试验结果可知， mAb 4D5是针对草鱼Ig分子重链的。鱼的血清Ig分子类似于脊椎动物的IgM 分子， 重链恒定区的氨基酸序列多， 结构复杂， 可提供多个抗原表位; 而轻链相对简单， 其上免疫表位少， 所以强阳性的细胞株绝大多数是抗重链的， 在筛选过程中抗轻链的杂交瘤细胞很容易被放弃和丢失。已报道的抗鱼Ig的mAb也是大部分只可以识别鱼的Ig重链， 仅有少量可以抗轻链[10]。
交叉实验结果表明: 5株mAb均不与台湾甲鱼、 泰国甲鱼、 日本甲鱼和中华鳖的血清反应， 除mAb 4B3外， 其余4株均与草鱼、 青鱼、 鲢鱼、 鳊鱼和花鱼骨的血清有明显的交叉反应， 而与鲫鱼、 鳗鱼的血清只有微弱的反应。mAb 4B3只与草鱼和青鱼的血清有反应， 而与其他血类血清反应很弱。从mAb的特异性试验的结果可看出， 不同鱼类的免疫球蛋白存在特异性抗原位点， 但也存在相同的抗原决定簇， 这种共同的抗原决定簇会存在于亲缘关系较近的品种之间。用不同浓度的草鱼IgM抗原包被ELISA板， 间接ELISA 法测定mAb 4D5的敏感性， 结果表明该mAb腹水间接ELISA 方法的检测草鱼IgM灵敏度为10 μg/L， 这种高灵敏性的mAb为草鱼传染性疾病的血清学和免疫学调查提供可靠的试剂， 也为进一步开展草鱼的免疫预防研究奠定必要的基础。
参考文献
[1] Li SF， Lu QQ， Zhou BY. Evaluation on the potential capacity of the swan oxbow for the conservation of the major Chinese carp[J]. Aquaculture， 1995， 137(5): 46-47.
[2] 陈红燕， 林天龙， 陈日升， 等. 抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析[J]. 中国水产科学， 2003， 10(2): 122-124.
[3] 王欣欣， 孙宝剑， 昌鸣先， 等. 草鱼免疫球蛋白M重链基因的克隆及表达[J]. 水产学报， 2008， 32(1): 13-19.
[4] 李亚南. 嗜水气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白分析[J]. 动物学报， 2001， 47(2): 132-138.
[5] 钱 超， 姜 平， 卢 春， 等. 抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(2): 213-215.
[6] 刘秀梵. 单克隆抗体在农业上的应用[M]. 安徽: 安徽科学技术出版社. 1994.
[7] Golding JW. Monoclonal antibodies: Principle and practice[M]. New York: Academic press， 1983: 53-54.
[8] 林天龙， 陈 强， 龚 晖， 等. 欧洲鳗免疫球蛋白单克隆抗体的制备与特性[J]. 水产学报， 2001， 25(6): 532-537.
[9] 汪家政， 范 明. 蛋白质技术手册[M]. 北京: 科学出版社， 2000.
[10] Van der Hejden MHT， Rooijakkers JBMA， Booms GHR， et al. Production， characterization and applicability of monoclonal antibodies to European eel(Angutllaanguilla L.) immunoglobulin[J]. Vet Immunol Immunopathol， 1995， 45(8): 151-164.