AP1和TGFβ1在低碘大鼠肾脏组织中的表达及意义

　　　　 作者：代永红， 张军， 刘长杰， 房辉

【摘要】 目的: 研究低碘培养对大鼠甲状腺功能的影响及激活蛋白1(activator protein1， AP1)和转化生长因子β1(transforming growth factorβ1， TGFβ1)在肾组织中的表达差异， 探讨低碘地区肾脏损伤的可能发病机制。方法: 给予Wistar大鼠低碘饲料， 通过饮用不同碘浓度的饮水来分组， 测定甲状腺功能状态。利用RTPCR方法分析肾脏组织中AP1亚单位cJun的激活变化情况。以免疫组化方法检测TGFβ1在肾组织中的表达差异。结果: 重度低碘组(DLIG)与轻度低碘组(GLIG)、 正常对照组(CL)比较FT3、 FT4均明显下降(P&<0.01)。GLIG与CL相比FT3明显下降(P&<0.05)， FT4稍有降低， 但差异无统计学意义(P&>0.05)。低碘大鼠肾脏组织中cJun mRNA及TGFβ1表达均增加， 与低碘程度有依赖关系。结论: 低碘摄入可引起甲状腺激素分泌紊乱， 甚至导致甲状腺功能减退， 与低碘程度有剂量依赖关系。低碘通过某种机制激活了AP1， 进而活化了TGFβ1等细胞因子， 产生一系列的连锁反应， 引起肾脏损伤。

【关键词】 低碘; 甲状腺激素; cJun; TGFβ1; 肾损伤

[Abstract] AIM: To observe the variation in expression of AP1 and TGFβ1 in rat kidney of iodine deficiency， to explore the nosogenesis of renal damage in the region of iodine deficiency. METHODS: The models of deficient iodine rats were established by treatment with low iodine diet， wistar rats were pided into gentle low iodine group(GLIG)， dense low iodine group(DLIG) and control group(CL). Serum levels of thyroid humone were determined by chemiluminescent immunoassay. To observe the gene expression of cJun by using RTPCR， observe the expression of TGFβ1 by using immunohistochemistry. RESULTS: Compared with CL， the FT3， FT4 of DLIG were significantly decreased(P&<0.01)， the FT3 of GLIG were significantly decreased(P&<0.01)， the FT4 of GLIG were not significantly decreased(P&>0.05). Compared with GLIG， the FT3， FT4 of DLIG were significantly decreased(P&<0.01). Compared with CL， GLIG group， the gene expression of cJun was significantly increased(P&<0.01) in DLIG group. Compared with CL group， the level of cJun was slightly increased(P&>0.05)in GLIG group. Compared with CL， the TGFβ1 of DLIG was significantly increased， the TGFβ1 of GLIG was significantly increased. Compared with GLIG， the TGFβ1 of DLIG was significantly increased. CONCLUSION: Iodine deficiency can decrease the secretion of thyroid humone， can lead the activation of cJun and TGFβ1 in kidney. This finding suggest that AP1 signal transduction pathway participate in the nosogenesis of renal damage.

　　[Keywords]iodine deficiency; thyroid homone; cJun; TGFβ1; renal damage

碘是机体必需的微量元素， 是甲状腺合成甲状腺激素的基本原料。机体在碘摄入不足的情况下会影响甲状腺激素的合成水平， 从而影响脑、 肾等靶器官的结构及功能， 特别是对于肾脏的损伤已被大量临床及动物试验所证实[1]， 但其确切的作用机制尚不清楚。本研究在成功复制低碘大鼠动物模型的基础上， 应用免疫组化和分子生物学方法， 探讨了低碘对大鼠肾组织中cJun与TGFβ1表达的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验分组 选择4～5周龄， 体质量70～100 g的健康Wistar大鼠60只， 雌雄各半(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)， 饲养于天津医科大学屏障环境动物实验室。将大鼠随机分为轻度低碘组(gentle low iodine group， GLIG)、 重度低碘组(dense low iodine group， DLIG)和正常对照组(control， CL)， 每组20只。

　　1.2 动物模型的复制 三组大鼠均给予低碘饲料饲养， 并通过给予不同碘浓度的饮水进行分组。三组大鼠的摄碘情况: CL 10 μg/d， GLIG 5 μg/d， DLIG 1.24 μg/d。适应喂养1周， 条件饲养16周后处死， 留取血清及肾脏等组织冻存于-80℃冰箱中， 其中一部分肾脏组织用40 g/L多聚甲醛固定备用。

　　1.3 甲状腺激素测定 采用化学发光免疫分析方法测定各组大鼠血清中的FT3、 FT4的水平， 测试仪器及试剂均为德国拜耳公司产品。

　　1.4 免疫组化 大鼠肾脏组织石蜡包埋后切片， 切片厚4 μm， 采用免疫组化方法检测肾组织中TGFβ1的变化情况(检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司)。结果判断: TGFβ1阳性反应为胞浆内可见棕褐色细颗粒。每份标本检测20个肾小球， 随机选择肾皮质小管及髓质小管各十个视野， 测定染色阳性区域的累积光密度与面积， 根据二者的比值， 计算单位面积平均光密度， 取其均值计算每个标本肾小球及肾小管的平均光密度， 以各组的均值进行组间比较。

　　1.5 RTPCR 取-80℃保存的肾脏组织， 利用TRIzol一步法抽提总RNA， 再逆转录成cDNA， 用PCR法扩增目的基因cJun。引物序列为: 上游5′CCAGCAATGGGCACATCACC3′， 下游5′CGTCTGCGGCTCTTCCTTCA3′， 产物长度455 bp。内参照βactin引物序列为: 上游5′CATCACTATCGGCAATGAGC3′， 下游5′ GACAGCACTGTGTTGGCATA3′， 产物长度156 bp。cJun扩增参数为: 预变性95℃ 5 min， 96℃×30 s+66℃×30 s+72℃×45 s×30个循环， 总延伸72℃ 10 min。扩增产物在12 g/L琼脂糖凝胶电泳中分离， 凝胶成像系统拍照分析， 计算特异扩增条带的总吸光度值， 并对目的基因与内参照的比值进行半定量分析。

　　1.6 统计学分析 所有数据均以x±s表示， 用SPSS13.0统计软件进行统计分析， 统计学方法采用单因素方差分析， 多个实验组之间的比较采用LSD检验。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠甲状腺功能比较 DLIG与GLIG和CL相比， 其FT3和FT4均明显下降(P&<0.01); GLIG与CL相比则FT3明显下降(P&<0.05)， 而FT4降低不明显(P&>0.05， 表1)。表1 各组大鼠甲状腺功能测定结果

　　2.2 免疫组化检测肾小球及肾小管中TGFβ1 从表2和图1可以看出， DLIG、 GLIG和CL 3组的TGFβ1检测结果均有差别(P&<0.05)， DLIG最高， GLIG次之， CL最低。　表2 各组大鼠肾组织中TGFβ1的检测结果

　　2.3 RTPCR检测肾脏组织中的cJun 各组(CL， GLIG， DLIG)大鼠肾组织中cJun的检测结果分别为0.98±0.14， 1.02±0.04和1.27±1.0， DLIG的cJun要高于GLIG(P&<0.01)和CL(P&<0.01); 而GLIG与CL的cJun则无统计学意义。

　　3 讨论

　　正常情况下， 机体吸收的碘的26%～50%储存在甲状腺内， 用于TH的合成。当体内碘不足时， 甲状腺中一碘酪氨酸(MIT)的生成增加， 二碘酪氨酸(DIT)生成减少， MIT/DIT增高， 继而偶合形成的三碘酪氨酸(TIT)相对增加， 四碘酪氨酸(FIT)即T4生成绝对减少， 因此碘不足早期或轻度缺碘， T3水平是增高的， 这种变化对防止缺碘时出现甲状腺功能减退是有益的[2]; 但在缺碘严重的机体代偿失调时T3水平也会下降。本试验中GLIG组及DLIG组FT3、 FT4均呈下降趋势， DLIG组下降更加明显。

　　在肾脏的急慢性炎症及间质纤维化的慢性进展中， 均可发现AP1的高表达[3， 4]。AP1属于基本亮氨酸拉链蛋白家族， 由Jun(cJun、 JunB、 JunD等)、 Fos(cfos、 FosB、 Fra1、 Fra2等)、 Maf(cMaf、 MafA、 MafB、 MafG/F/K和Nrl)或ATF(ATF2、 LRF1/LRF3、 BATF、 JDP1和JDP2)组成的同型或异型二聚体， 可以识别TPA反应元件(5′TGA(C/G)TCA3′)或cAMP反应元件(CRE， 5′TGACGTCA3′)从而激活下游的蛋白表达[5]。其中Jun蛋白占绝大部分， 可以与任何AP1家族因子结合形成同源或异源二聚体， 因此本研究用RTPCR检测AP1的亚单位cJun基本能反映AP1的表达情况。本研究发现， cJun在CL组大鼠肾脏有基础量的表达。AP1在正常肾组织中表达的生理意义尚不清楚， 实验证明， cJun缺陷小鼠在胚胎发育的中、 晚期即死亡， 其肝脏呈现出明显的形态学异常， 并出现全身水肿[6]。在用羟基脲诱导小鼠胚胎畸形试验中， 卵黄囊和胚胎组织中cFos的表达明显上升， 说明cFos对胚胎正常发育起保护作用[7]。本研究结果表明， cJun mRNA在低碘大鼠肾组织中的表达增强， 在GLIG组的表达呈增高趋势， 为CL组的1.1倍， 在DLIG组的表达明显增高， 为CL组的1.3倍。说明低碘通过某种机制激活了AP1， 随低碘程度的增加， AP1的活性显著增强。

　　本研究发现， TGFβ1在CL组大鼠肾组织中少量表达， 在GLIG组大鼠肾组织中表达明显增高， 在DLIG组中的表达更加增高; 在CL及GLIG组大鼠的肾小球和肾小管中的表达无明显差异， 在DLIG组大鼠肾小球内的表达明显高于肾小管。我们据此推测， TGFβ1是介导甲状腺激素不足肾脏损伤的重要细胞因子。TGFβ1的基因启动子中含有两个AP1结合位点(位于-453至-323之间)， 其中任何一个应用AP1特异性抑制剂curcumin均能阻断TGFβ1的基因表达， 表明TGFβ1基因转录是AP1依赖性的[8]。Weigert等[9]发现， 低分子肝素可抑制TGFβ1上的AP1结合位点， 从而阻断了高糖诱导的TGFβ1的表达。目前已证实， 许多刺激因素如AngⅡ等， 均是通过PKCAP1信号转导途径诱导TGFβ1mRNA表达的上调。因此， AP1的激活可诱导TGFβ1表达的上调。

　　我们推测低碘引起甲状腺激素分泌减少， 进而通过某种机制激活了肾组织中AP1的信号转导途径。AP1通过活化TGFβ1等细胞因子参与了肾损伤的发病机制。如果低碘状况持续无改善， 会导致肾小球硬化、 肾小管间质纤维化， 最终发生肾功能衰竭。提示AP1可能成为一个潜在的分子治疗靶， 抑制它的激活可能延缓病情进展， 减轻组织损伤。

参考文献

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