Rh抗原Fab抗体库的构建与筛选

　　作者：陈琦　， 张嘉敏， 张海燕， 朱自严， 李厚达

【摘要】 目的: 构建抗体库并筛选Rh抗原的Fab抗体。方法: 收集5份血清中抗Rh抗体效价在1∶256～512的人淋巴细胞， 提取RNA， 用多对引物PCR扩增VH、 Vκ、 Vλ基因， 并分别从pComb3xTT和pComb3xλ噬粒中扩增CH1、 Cκ、 Cλ， 通过重叠PCR， 构建重链Fd基因及完整的kappa、 Lamda轻链， 并进一步重叠PCR， 获得Fab抗体片段。Fab经酶切、 连接并电转化到噬菌体抗体表达载体pComb3xSS中， 构建获得抗Rh的Fab抗体库， 经4轮Rh(-)/ Rh(+)红细胞阴/阳淘筛， 获得的阳性克隆分别进行血凝试验、 Western blot分析及测序鉴定。结果: 构建获得总库容为7.4×106的Fab抗体库， 并从中筛选得到1株能特异结合Rh抗原的Fab抗体。结论: 应用基因工程抗体技术， 成功获得了1株能与Rh(+)红细胞特异凝集的Fab抗体， 为制备能用于临床的特异性强、 效价高， 并具有自主知识产权的Rh抗体打下基础。

【关键词】 Rh血型; 基因工程抗体; 噬菌体抗体库; Fab

　　[Abstract] AIM: To Construct Fab antibody against Rh antigen. METHODS: The variable regions of light and heavy chains were amplified by RTPCR from the PBMCs of volunteers with high titer (1∶256512 by inditect agglutation) antibody to Rh antigen. Meanwhile， the genes of constant regions of light and heavy chains were isolated from pComb3xTT and pComb3xλ phagmid carrying the templates respectively. Vκ light chain and Fd heavy chain were linked by the first splicing overlapping extension PCR (SOE)， and a fulllength Fab gene was created by the second SOE. The Fab gene was ligated to phagmid pComb3HxSS and transformed to E.coli XL1Blue by electroporation. The obtained human Fab phage antibody library was panned using Rh(-)/Rh(+) RBC four times. the phage antibodies against Rh antigen were highly enriched. Indirect agglutation test， western blot analysis and sequencing analysis were performed to detect the specificity of Fab against Rh. RESULTS: The repertoire of human phage display Fab library was 7.4×106. After panning， A Fab clone which could bind to Rh antigen specifically was obtained. CONCLUSION: A Fab antibody that specifically aggulated Rh(+) RBC is obtained， this makes it possible to produce Rh antibody with high quantity and effection in our country.

　　[Keywords]Rh antibody; genetic engineering antibody; phage display antibody library; Fab

Rh血型是人类29个血型系统中最复杂、 最富有多态性的一种， 该血型根据红细胞表面是否有Rh抗原分为Rh(+)和Rh(-)两种。其临床重要性表现在: 在Rh(-)人输入Rh(+)血后会产生Rh抗体， 若再次输入Rh (+)血， 则该受血者红细胞会因抗原、 抗体反应发生溶血， 从而引起严重的输血反应; 而有Rh抗体的Rh(-)妇女怀孕时， 母亲血中的抗体可通过胎盘进入胎儿体内， 若胎儿是Rh(+)血， 产生的免疫反应重则导致胎儿死亡， 母亲流产， 轻则引起新生儿溶血病的发生[1]。因此， Rh血型的临床意义仅次于ABO血型系统。在欧美等国， 进行Rh血型检测已成为输血前的常规检查项目， 故由该血型不合导致的种种并发症极少发生[2]。但在我国， 因Rh定型试剂即Rh抗体严重匮乏， 医院在输血前只鉴定ABO血型， 不做Rh血型的检测， 以至大多数人直到出现了严重的输血反应后， 才得知自己是Rh(-)血， 这对保障人民生命安全造成了严重的影响[3]。因此， 廉价、 足量且效价高的Rh抗体的获得是避免输血反应、 保证输血安全的关键。本研究旨在通过基因工程抗体技术构建并筛选Rh血型的Fab抗体， 为制备我国具有自主知识产权的Rh抗体打下基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 菌株、 培养基和试剂 噬菌体抗体表达载体pComb3xSS、 pComb3xTT和pComb3xλ噬粒由焦永军博士惠赠。雄性大肠杆菌XL1blue (F+)， 辅助噬菌体VCSM13由本室保存。5人份Rh抗体阳性人的外周血淋巴细胞及“O”型血红细胞由上海市血液中心提供。限制性内切酶、 T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司。总RNA 提取试剂盒、 逆转录试剂盒购自Promaga公司。兔抗鼠M13抗体购自Pharmacia公司。

　　1.2 引物 (1)重链(VH)、 轻链(Vκ 、 Vλ)可变区引物 HFabVH1F: 5′GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTG GTG CAG GTG CAG CAG TCT GG 3′; HFabVh3F: 5′GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CAG AAG GAG ATC ACC TTG TCT GG3′; HFabVH3F:5′GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC TGC AGC TGK GAG GTG GAG TCT G3′;HFabVH4F: 5′GCT GCC CCA GCC CAA ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG3′;HFabVHJaB: 5′CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC3′;HFabVHJbB: 5′CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC WGR GGA GAC GGT GAC CAG GGT BCC3′; HSCK1F: 5′GGG CCCAGGCGAGCTCCAGGCCGATGACCCAGTCTC C3′; HSCK2F; 5′GGGCCCAGGCGGCCGAGACYCACTCGTGATGGTCTCC3′; HSCK3F: 5′GGGCCCAGGCGAGGGCTCGTGCCGAWTCRCAGTCTC C3′; HSCK5F: 5′GGGCCCGAGCTCAGGCCACGGCACTCACGCAGTCTCC3′; HSCK5B: 5′GAAGACAGGCCAATGGTGCACAGT3; HSCLam1a: 5′GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGB TGA CGC AGC CGC CCT C3′; HSCLam1b: 5′GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AGC CAC CCT C3′; HSCLam2: 5′GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG CCC TGA CTC AGC CTC CCT CCG T3′; HSCLam3: 5′GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AGC TGA CTC AGC CAC CCT CAG TGT C3′;HSCLam4: 5′GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AAT CGC CCT C3′; HSCLam6: 5′ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCA TGC TGA CTC AGC CCC ACT C 3′; HSCLam7: 5′GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGG TGA CYC AGG AGC CMT C3′; HSCLam9: 5′GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AGC CAC CTT C3′;HSCLam10: 5′GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG GGC AGA CTC AGC AGC TCT C3′; VHCL5B: 5′CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC3′; (2)重链(CH)、 轻链(C 、 C )恒定区引物 HIgGCH1F(sense): 5′GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC3′; dpseq (reverse): 5′AGA AGC CGG AAC GTA GTC GTC3′; HKCF (sence): 5′CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC3′; LeadB (reverse): 5′GGC TGG TTG CAT GGC GGC AGC3′;HLCF(sense): 5′GGT CAG GCT GCC CCC AAG CCC3′;(3)组装引物 Lead VH(sense): 5′GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC3′; RSCF(sense): 5′GAGGAGGAGGAGGGCGGGGGAGGACCCAGGCGG CCGAGCTC3′;dpEX(reverse): 5′GAG GAG GAG AGC GTA GTC GAG GAG GAG AGA CGG AAC GTC3′。

　　1.3 方法

　　1.3.1 外周血淋巴细胞的采集及总RNA提取 收集5人份符合条件的抗凝血， 分离淋巴细胞。按照TRIzol说明书提取淋巴细胞总RNA， 以Oligo(dT)为引物逆转录合成单链cDNA。献血者应符合以下条件: O型血、 Rh抗原阴性、 血清中有抗Rh抗体(5人份抗凝血的Rh抗体效价在1∶216-512之间)。

　　1.3.2 重叠PCR扩增Fab 用VH、 Vκ、 Vλ、 CH、 Cκ、 Cλ引物进行第1轮PCR， 分别获得抗体重、 轻链可变区的VH、 Vκ、 Vλ基因及重、 轻链恒定区的CH、 Cκ、 Cλ基因; 用Lead VH和RSCF引物进行第2轮PCR分别扩增重链Fd及轻链kappa、 Lamda; 用dpEX和RSCF引物进行第3轮PCR将Fd与kappa链及Fd与Lamda 分别组装成Fab。反应条件均为94℃变性30 s ， 55℃退火30 s ， 72℃延伸90 s ， 30个循环后， 再72℃延伸10 min ， 产物在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳。

　　1.3.3 Fab抗体库的构建 XL1Blue挑单菌， 转接种于2 mL SBTT中， 辅助噬菌体10-6、 10-7、 10-8用SBTT稀释， 取1 μL XL1Blue加50 μL稀释的辅助噬菌体， 混匀， 加3 mL顶层琼脂(50℃)， 倒入LB板， 37℃， 过夜， 第2天计算滴度。将单噬菌斑挑至XL1Blue中， 加Kan过夜扩增， 沉淀， 4℃保存。用SfiI酶切pComb3 SS， 在T4 DNA连接酶作用下将pComb3 SS与Fab连接， 并将连接产物电转化大肠杆菌XL1blue， 转化产物测滴度。其余继续扩增: 加15 mL， 250 r/min， 1 h， 加4.5 μL Amp， 250 r/min， 1 h。加1 mL VCSM13(1015～1018 pfu/mL)， 转入500 mL烧瓶， 加183 mL预温SBT， 300 r/min， 过夜。上述培养物用PEG8000/NaCl沉淀后， 0.2 μm膜过滤， 加入0.2 g/L叠氮钠， 此即为抗体库。

　　1.3.4 Fab 抗体库的淘筛 取4%悬浮Rh(+)和Rh(-)红细胞， PBS洗3次， 最后1次重悬于100 μL的30 g/L BSAPBS中， 待用。取100 μL 滴度为1015～1018 pfu新鲜待筛库加Rh(-)细胞， 室温30 min， 离心取上清， 加Rh(+)细胞， 室温1.5 h。离心， 沉淀用冰冷PBST洗6次。用300 μL洗脱液(76 mmol/L柠檬酸， ph3.4)， 室温10 min洗脱后， 立即用20 μL中和液(2 mol/L Tris Base， pH约10.5)中和， 随后转至一125 mL烧瓶中扩增、 沉淀， 方法同前。以上过程重复4次。

　　1.3.5 血凝试验初步鉴定筛选获得的Fab抗体库 人Rh(+)和Rh(-) RBC经PBS 洗涤后调成2×1011/L， 取一滴分别加入100 μL 噬菌体抗体液， 100 μL 1640稀释的兔抗鼠M13抗体， 加到96孔U 形底微量板中， 混匀， 静置1 h观察结果。无凝集反应的RBC 沉降后在孔底形成点状沉积， 发生了凝集反应的RBC 则呈片网状沉积。

　　1.3.6 单个克隆噬菌体Fab抗体的活性及特异性鉴定 随机挑取16 个筛选4 轮后的单个克隆， 按前述方法用辅助噬菌体感染、 扩增及PEG/NaCl沉淀， 获得在噬菌体表面展示有Fab的单个克隆的噬菌体抗体上清。用红细胞凝集试验检测单克隆Fab抗体活性(方法同上)。用Western blot鉴定Fab抗体特异性， 即将Rh(+)、 Rh(-)红细胞裂解， SDSPAGE电泳， 电转移后， 加入浓缩的可溶性Fab抗体上清液， 辣根过氧化酶标记的羊抗人Fab为二抗， 按文献方法进行免疫印迹试验， DAB 显色。

　　1.3.7 DNA序列测定 选血凝试验阳性， Western blot分析有目的条带的单个克隆送测序。

　　 2 结果

　　2.1 Fab抗体基因片段的获得 第1轮PCR 扩增获得了抗体多种不同亚群的VH、 Vκ、 Vλ， 同时以pComb3 xTT、 pComb3 x λ噬粒为模板分别扩增了CH1、 Cκ、 Cλ基因， 它们均为350～400 bp。以第1轮PCR获得的VH、 Vκ、 Vλ、 CH1、 Cκ、 Cλ为模板， 进行第2轮PCR， 分别扩增获得重链Fd及轻链kappa、 Lamda， 它们的均为750～800 bp。以第2轮获得的Fd、 kappa、 Lamda为模板， 进行第3轮PCR， 获得Fab基因， 约1 500 bp， 与预期结果相符(图1)。

　　2.2 Fab抗体库的构建 将Fab片段与pComb3xSS 分别用sfiI单酶切后连接， 经多次电穿孔转化， 合并成库容为7.4×106抗体库。随机挑18个克隆， PCR检测Fab转入效率约为94%。

　　2.3 Fab抗体库的淘筛及血凝初筛 用Rh(-)和Rh(+)红细胞对噬菌体Fab抗体库进行了4 轮富集筛选， 每轮对从Rh(+)红细胞表面洗脱下来的噬菌体颗粒进行了滴度测定， 显示洗脱下来的噬菌体量逐渐升高， 提示有特异性的富集(表1) 。将第4轮洗脱下来的抗体库用Rh(-)和Rh(+)红细胞进行血凝初筛， 发现抗体库可使Rh(+)明显血凝， 而Rh(-)不凝， 表明此筛选后抗体库中已有特异的抗RhD的Fab抗体(图2)。

　　2.4 单个克隆噬菌体Fab抗体的活性及特异性鉴定 挑取7个在噬菌体表面展示有Fab的单个克隆的噬菌体抗体上清， 进行血凝实验， 其中2个与Rh(+)红细胞有血凝反应， 而与Rh(-)血不凝， 此为分泌抗Rh的Fab抗体的阳性克隆， 分别命名为抗RhFab1和抗RhFab2(图3)。抗RhFab1进行Western blot的结果显示: 27和24KD处有Fd和轻链目的条带。表1 筛选对特异性噬菌体抗体的富集

　　2.5 DNA测序结果 取抗RhFab1和抗RhFab2克隆测定其DNA序列， 发现二者Fd和Vκ完全相同， 同源性为100%， 因此是2个相同的重复克隆。经计算机检索Kabat分类数据库， 发现2者的VH均属VH3-23亚群家族， 其同源性达99.3%， Vκ属VκⅢ亚群Ⅸ家族， 其同源性达100%。

　　3 讨论

　　Rh血型主要有D、 C、 E、 c、 e 5种抗原， 其中D抗原性最强， 因此， 一般获得的Rh抗体均为抗D抗体。Rh抗体的制备经历了从多克隆(抗血清)、 单克隆， 再到基因工程抗体3个阶段。Rh抗血清的获得需对Rh阴性个体反复注射Rh阳性血， 这有悖于伦理道德， 且来源极为有限， 目前已被禁止[4]， 而小鼠免疫系统不识别Rh抗原， 用传统杂交瘤技术无法获得Rh mAb， 虽经对mAb技术的改进， 如EB病毒转化、 人人或人鼠杂交瘤等最终获得了一些Rh抗体， 但这些瘤株细胞存在不稳定、 易丧失抗体分泌能力等缺陷[5]， 这使Rh抗体的大规模生产受到很大限制。基因工程抗体技术的出现及发展则为Rh人源性抗体的制备提供了重要的技术平台。

　　基因工程抗体技术在制备Rh抗体方面的最大优势在于绕过了mAb制备中动物免疫这一环节， 只需Rh抗体阳性人提供少量白细胞， 用单纯的分子生物学技术即可获得， 因此是完全的人源性抗体。在实际应用方面， 此类抗体一般为Fab或ScFv形式， 它们比mAbs分子量小， 能更好地与Rh抗原结合， 作为检测试剂它们比mAbs更优越[6]。Chang等[7]构建了Rh的Fab抗体库， 并用磁珠法筛选获得了有血凝活性的Fab; Miescher等[8]通过筛选， 挑出两个表达Fab的高亲和性噬菌体克隆， 并首次在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。据统计， 目前国外文献报道的抗Rh的ScFv或Fab抗体已达100余种。而在我国， 目前临床分型用的Rh抗体全部依赖于进口， 没有自主生产Rh抗体的报道。

　　我们利用Rh抗体效价达1∶216-512的人血液淋巴细胞构建了Fab免疫抗体库， 该免疫库中针对Rh抗原的特异性的抗体丰度大大高于其他非特异性抗体， 因此也极大地增加了筛选获得高亲和力、 高特异性抗Rh抗体的可能性。在Fab抗体库的构建过程中， 用了多对引物， 并采用重叠PCR的方式， 最后获得的Fab抗体库库容为7.4×106。经过Rh(+)/Rh(-)红细胞的4轮筛选， 获得2株能与Rh(+)血特异凝集的阳性克隆， 最终测序结果显示， 它们是重复克隆(即只获得一个阳性克隆)。这种现象在用噬菌体抗体库制备抗体的文献中多有报道， 分析原因， 可能是噬菌体对表达在其表面的抗体基因也存在一个“优选”过程， 最终获得的克隆也是比较适合在噬菌体表达和操作的抗体基因。

　　有血凝活性的抗Rh Fab抗体是我国文献报道的第一个通过基因工程技术获得完全人源化的抗Rh抗体， 这为我们对其进一步优化， 并最终大量生产用于临床打下了基础。

参考文献

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　　[2] 吕 辉. Rh血型筛查及Rh阴性患者输血的分析[J].　国际检验医学杂志， 2007(1)， 15(2): 32-34.

　　[3] 李 卉， 刘 子. 抗RhD抗体及其应用[J]. 生物技术通讯， 2005， 16(1): 77-82.

　　[4] 岳建华， 潘秀珍， 唐家琪. 抗RhD血型抗体制备的研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2005， 21(1): 46-48.

　　[5] Roya P， Khaja P. Specificity and isotype of Rh specific antibodies produced by human Bcell lines established from alloimmunized Rh negative womeny[J]. Transfusion and Apheresis Science， 2005， 33(2): 119-127.

　　[6] Antonietta ML， Kathleen M. McKenzie. PhageDisplayed Antibody Libraries[J]. Cell Biology， 2006， 32(6): 491-496.

　　[7] Chang TY， Siegel DL. Genetic and immunological properties of phagedisplayed human antiRh(D) antibodies: implications for Rh(D) epitope topology[J]. Blood， 1998， 91(4): 3066-3078.

　　[8] Miescher S， Vogel M， Biaggi C， et al. Sequence and specificity analysis of recombinant human Fab antiRh D isolated by phage display[J]. Vox Sang， 1998， 75(4): 278-284.ISSN1007-8738