多肽类结核杆菌抗原激活的γδ T细胞表达抗原提呈细胞表型和功能

【摘要】 目的: 观察用多肽类结核杆菌耐热抗原(MtbHAg)激活的人外周血γδ T细胞是否具有抗原提呈细胞的表型和抗原提呈作用。方法: 外周血单个核细胞(PBMC)经贴壁法获取单核细胞， 加GMCSF， IL4和LPS培养诱导为成熟DC。PBMC用MtbHAg优势扩增γδT细胞后用流式分选纯化γδ T(Vδ2+)细胞。PBMC经尼龙毛柱法获得纯化T细胞， 用CFSE标记后单独加Mtb分泌性抗原(MtbSAg)， 或加单核细胞和MtbSAg共同培养， 或与经MtbSAg预处理的成熟DC或活化γδT细胞共同培养。第11天时用流式细胞术检测CD4+T细胞的增殖。MtbHAg活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg孵育不同时间后用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测摄入情况。结果: MtbHAg活化的γδ T细胞CD80， CD86和MHCⅡ类分子的表达显著增加。MtbSAg预处理活化的γδ T细胞诱导初始T 细胞增殖数和CD4+T细胞增殖指数的活性与成熟DC相似。MtbHAg活化的γδ T细胞能摄入FITC标记的MtbSAg。结论: 用多肽类 MtbHAg激活的γδ T细胞具有抗原提呈细胞的表型， 并具有摄入和提呈可溶性抗原给初始T淋巴细胞的能力。

【关键词】 结核分枝杆菌; 抗原提呈; T细胞亚群; 流式细胞术; 激光共聚焦显微镜

　　［Abstract］ AIM: To explore whether the human peripheral γδ T cells stimulated by polypeptide heat resistant antigen from Mycobacterium tuberculosis (MtbHAg) express phenotype and have the fuction of antigen presentation. METHODS: The monocytes isolated by adhesion method from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured with GMCSF， IL4 and induced into the mature dendritic cells by adding LPS. PBMCs were stimulated with MtbHAg and IL2 to expand predominantally γδ T cells that were further purified by flow sorting. The pure T cells were isolated from PBMCs using adhesion revomal and nylon column method， labeled with CFSE， and cultured in alone with Mtb secretory antigen (MtbSAg)， in monocytes with MtbSAg， or with MtbSAg prepulsed dendritic cells or MtbHAg activated γδ T cells for 11 days. The proliferation of the CD4+T cells were measured by flowcytometry. The MtbHAg activated γδ T cells were incubated with FITC labelled MtbSAg for different time， and the ingestion of MtbSAg by γδ T cells was measured by flowcytometry and observed with laser confocal microscopye. RESULTS: The expressions of MHCII and costimulatory molecules CD80 and CD86 on γδ T cells that activated by MtbHAg marketly incrased in comparison with that on the resting γδ T cells. The expanded cell counts and proliferation index of the pure nave T cells that induced by MtbSAg pretreated activated γδ T cells were similar to that induced by mature DC. By using flowcytometer and laser confocal microscope， FITC labellaed MtbSAg was ingested by the activated γδ T cells. CONCLUSION: γδ T cells stimulated by polypeptide MtbHAg express the phenotype of professional antigenpresenting cells and they are able to present MtbSAg to nave T cells to induce the proliferation of CD4+T cells.

　　［Keywords］Mycobacterium tuberculosis; antigen presentation; T lymphocyte subpopulation; flow cytometry; laser confocal microscope

以往的研究表明机体在抗结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染免疫中， 主要有αβ T细胞（CD4＋和CD8＋T细胞）和巨噬细胞发挥重要作用， 而近年的许多研究证明， γδ T细胞在抗Mtb感染中也起到重要的防御作用， 并可能通过与其他免疫细胞之间相互作用， 影响机体在抗Mtb感染中的免疫应答过程。在健康人外周血中， γδ T细胞仅占T细胞库的2%～10%， 根据其TCRδ链V区片段不同又可以分为Vδ1+和Vδ2+二种亚型， Vδ1+T细胞主要分布在黏膜上皮和皮肤组织， 而Vδ2+T细胞则主要分布在外周血中。已有研究发现Vδ2+T细胞能识别小分子的非肽类抗原， 并在此类抗原的刺激下产生显著的扩增［1， 2］。有研究发现， 从扁桃体分离的未活化的γδ T细胞用异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate， IPP) 和来自大肠埃希菌的非肽类抗原4羟基3甲基2烯基焦磷酸［(E)4hydroxy3methylbut2enyl pyrophosphate， HMBPP］刺激后， 表达协同刺激分子和MHCⅡ类分子的能力与单核细胞来源的， 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激诱导成熟的树突状细胞（dendritic cell， DC）相似［3］。但以往的研究， 以及我们以前的实验发现来自结核杆菌的多肽类耐热抗原也可优势扩增人Vδ2+T细胞［4， 5］。本实验中， 我们用多肽类Mtb耐热抗原(Heat resistant antigen， MtbHAg)优势扩增人外周血中的γδ T（Vδ2+）细胞， 观察活化后的γδ T细胞是否能表现出抗原提呈细胞的表型以及是否具有抗原提呈的功能， 探讨γδ T细胞在抗Mtb感染的天然免疫和获得性免疫中的桥联作用。

1 材料和方法

　　1.1 材料 Mtb耐热抗原(MtbHAg)和Mtb分泌性抗原(MtbSAg)由本实验室从培养的MtbH37Ra株制备获得， 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFSE) 购自Molecular Probes公司; RPMI1640培养液(GIBCO公司) 补充L谷氨酰胺2 mmol/L、 二巯基乙醇(2ME)50 μmol/L、 丙酮酸钠1 mmol/L、 庆大霉素50 mg/L和新生小牛血清(NBS， 杭州四季青公司) 100 mL/L后为完全RPMI1640培养液; 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC) 和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide， DMSO) 购自Merk 公司; 荧光抗体小鼠抗人CD4PE、 小鼠抗人TCRγδPE、 小鼠抗人CD14FITC、 小鼠抗人HLADRPecy 5.5和小鼠抗人CD83FITC等购自Caltag公司; 小鼠抗人CD80FITC和CD86FITC购自eBioscience公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 γδ T细胞的活化和分选纯化 抽取健康志愿者外周血5～10 mL， 肝素抗凝， 用淋巴细胞分离液和梯度离心法常规分离获取外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cells， PBMC）， 将PBMC用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为1×109/L， 加入24孔板， 再加入Mtb耐热抗原(MtbHAg) 2.5 mg/L， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培养5 d后分孔培养， 每隔3 d加入rhIL2 5×104 U/L， 约9 d即可得到富含γδ T细胞的活化T细胞， 经抗TCRPE染色后， 用PBS制备分选用细胞悬液(1×1010/L)， 在流式细胞仪FACSCalibur上进行分选获取纯化的γδ T细胞。

　　1.2.2 DC的体外培养及检测 常规方法分离获取PBMC， 加入24孔板中， 细胞密度为每孔5×109/L， 37℃、 50 mL/L　　 CO2培养2 h后吸去悬浮细胞， 并用预热的RPMI1640轻洗培养孔， 以去除残留悬浮细胞， 即获得贴壁细胞。补充培养液后加入rhGMCSF 100 μg/L， IL4 100 μg/L， 第3天时半量换液， 并再次添加GMCSF和IL4， 第6 天半量换液的同时再加入LPS 1 mg/L， 第8天收获悬浮细胞， 分别用小鼠抗人CD83FITC， CD14FITC和HLADRPeCy5.5标记后在流式细胞仪检测外周血单核细胞来源DC的成熟程度。

　　1.2.3 尼龙毛柱法分离纯化T淋巴细胞 常规方法分离获取PBMC， 调整细胞密度为1×109/L， 加入6孔板中， 2 mL/孔， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培养2 h后， 吸出悬浮细胞， 调整细胞密度为1×1010/L， 注入已制备好的尼龙毛柱内， 另加入5 mL的完全RPMI1640液， 密封， 37℃、 50 mL/L CO2中孵育1 h后， 用RPMI1640完全培养液冲洗毛柱， 收集冲洗出来的细胞， 即为纯化T细胞（purified T， pu T)。

　　1.2.4 CFSE标记pu T 将获得的pu T调整细胞密度为5×109/L， 每毫升细胞悬液加入1 μL CFSE， 使其终浓度为2 μmol/L， 37℃染色10 min后取出用含100 mL/L NBS的完全RPMI1640培养液洗2次后将染色后pu T制成细胞悬液(1×109/L)。此即为CFSE标记的pu T (pu TCFSE)。

　　1.2.5 FITC标记MtbSAg 将MtbSAg(1 g/L) 1 mL加入已处理过的透析袋中， 扎紧袋口放入pH9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后取出， 加DMSO配制FITC溶液（1 g FITC/L）混合， 使FITC/MtbSAg的比例为50 μg∶1 mg。室温避光在水平振荡器上慢速振摇2 h后转入透析袋中， 对200 mL PBS透析8 h后换液， 共3次。4℃避光保存。

　　1.2.6 四种不同的培养方法刺激αβ T细胞扩增 CFSE标记的pu T， 调整细胞密度为1×109/L， 加入24孔板培养， 每孔1 mL， 并按以下四种不同方法加入MtbSAg或抗原提呈细胞。a: CFSE标记的pu T单独培养， 同时加入MtbSAg 25 mg/L。b: CFSE标记的pu T中加入单核细胞 (单核细胞: pu TCFSE为1∶100)， 加MtbSAg 25 mg/L。c: 体外培养的单核细胞来源的成熟DC(MDC)与终浓度25 mg/L 的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗涤3次， 加入pu TCFSE (DC∶Pu TCFSE为1∶100) 中培养。d: 流式分选纯化的MtbHAg活化γδT细胞与终浓度为25 mg/L的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗涤3次， 加入到pu TCFSE(活化的γδT细胞: pu TCFSE为1∶100)中培养。上述4种细胞培养在第4天时加IL2 (5万U/L)扩增细胞， 隔天半量换液并添加同量的IL2以维持细胞生长。

　　1.2.7 FCM和激光共聚焦检测活化γδ T细胞对FITC标记MtbSAg的摄入 将MtbHAg活化的γδ T细胞的密度调整为1×1010/L， 取100 μL细胞悬液， 加FITC标记的MtbSAg 10 μL， 抗TCRγδPE 3 μL， 避光 37℃， 水浴30 min 至120 min后， PBS洗涤3次， 尽量去除残余液体， 加入10 g/L多聚甲醛200 μL 固定后用流式细胞仪检测FITC阳性细胞数， 表示摄入MtbSAg细胞的比率。同时将水浴90 min的试管轻弹混匀后取出2 μL， 加少量甘油混合后滴在载玻片上， 加上盖玻片后即在激光共聚显微镜（Nikon C1 Si）下观察和拍摄记录， 获取的图象文件用Freeviewer软件分析显示。

　　1.2.8 统计学分析 实验数据以x±s表示， 数据处理采用SPSS13.0统计软件。样本均数的两两比较， 采用t检验， P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

　　2.1 外周血单核细胞来源DC的表型检测 PBMC来源的单核细胞经GMCSF， IL4培养6 d后加入LPS诱导为成熟的DC后， 用FCM检测其表型， 发现HLADR仍为高表达（81.89%)， 代表DC成熟的CD83与培养前低表达（7.83％）相比非常显著地高表达(85.40%)， 而单核细胞的特征标志CD14从培养前的87.2%降低到5.31%。

　　2.2 活化的γδT细胞表达协同刺激分子 检测健康人外周血中静止的γδ T细胞表面CD80、 CD86和HLADR的表达水平非常低， 分别为(1.37±2.36)%， (4.13±3.33)%和(8.84±5.44)%; 而经MtbHAg活化后γδ T细胞CD80、 CD86和HLADR的表达分别增加到(62.33±7)%、 (89.12±3.5)%、 (80.56±7.29)% (图1)。

　　2.3 不同培养方法对纯化初始T细胞增殖总数的影响 在4种不同培养方案中， 加入的纯化T细胞数均为1.0×106， 单独加MtbSAg的a组， 和加单核细胞和MtbSAg的b组， 培养到第11天时， 细胞数分别为1.2×106和5.6×106。而纯化T细胞加入预先与MtbSAg处理的DC（c组）和γδ T细胞（d组）， 培养11 d后的细胞数分别为7.79×106和8×106(图2)。

　　2.4 FCM分析CD4+T细胞的增殖情况和Modfit软件分析CD4+T细胞的增殖指数 用CFSE标记的纯化T细胞用4种方法培养到第11天时， 标记CD4荧光mAb后用流式细胞仪测定和分析， 结果表明纯化T细胞单独加MtbSAg的a组， 增殖的CD4+T细胞仅占4.5%; 加单核细胞和MtbSAg的b组， 增殖的CD4+T细胞所占比例为35.4%， 而加入MtbSAg预处理的成熟DC和活化γδT细胞的c组和d组， 增殖的CD4+T细胞所占比例分别达到56.4%和57.1%（图3A）。用Modfit软件中的增殖分析模块进行分析， 得到CD4+T细胞各代细胞所占百分率， 增殖指数(Proliferation Index， PI， 即增殖后细胞总数与增殖前细胞总数的比值。在加入MtbSAg预处理的DC（c组）和活化γδT细胞（d组）， 培养第11天时CD4+T细胞的PI分别为58.9和51.9， 且增殖的代数主要集中在第9、 10代， 分别为75.93%和75.71%。加入单核细胞的b组CD4+T细胞的PI为24.39， 第9、 10代所占的比例为57.65%， 而仅有纯化T细胞的a组中， CD4+T细胞的PI和第9、 10代所占的比例仅为4.5%和4.04%（图3B）。

　　2.5 激光共聚焦显微镜观察活化的γδ T细胞摄入SAg MtbHAg刺激活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg在37℃孵育90 min 时， 同时加入抗TCRγδ PE荧光抗体， 在激光共聚焦显微镜下观察， 发现细胞膜被染成红色的γδ T细胞内分布有大量呈绿色荧光（FITC）细小散点物质(图4)。

　　2.6 流式细胞术检测活化的γδ T细胞摄入MtbSAg MtbHAg激活的γδ T细胞与FITCMtbSAg在37℃孵育时， 加入抗TCRγδ PE荧光抗体， 用流式检测发现， MtbSAg摄入率即γδ T细胞中FITC+细胞百分数随时间延长不断增加。在孵育30、 60和90 min时， 摄入率分别为(26.68±3.58)%、 (48.09±3.29)%和(53.32±3.29)%; 但是在120 min时降低至(31.28±5.80)% (图5)。

3 讨论

　　为了探讨多肽类抗原激活的人γδ T细胞是否也具有抗原提呈作用， 首先考虑是否有涉及抗原提呈细胞有关的表型分子的表达。本实验采用多肽类的MtbHAg作为优势激活γδ T细胞的抗原， 其中具有激活γδ T细胞效应的主要组分是Mr在10 000～14 000的非分泌性耐热多肽［4， 5］。用这种多肽抗原激活的γδ T细胞在培养增殖到第11天时， 其表面HLADR和协同刺激分子(CD80和CD86)从培养前的低表达（1％～8％）显著上调为高表达（62％～89％）， 表明这些细胞已具有抗原提呈细胞的表型。

　　Brandes等［3］发现IPP活化γδ T细胞摄入可溶性抗原后与初始αβ T细胞共同培养促使细胞增殖。本实验中纯化T细胞（几乎均是αβ T细胞）与MtbSAg掺入的DC培养11 d后数量增加7倍， 而与MtbSAg掺入的活化γδ T细胞共同培养后， αβ T细胞的数量增加8倍。我们进一步用CFSE标记初始纯T淋巴细胞后， 再与MtbSAg掺入的DC或γδ T细胞培养， 流式细胞术检测后用Modfit软件进行分析CD4+T细胞各代细胞所占百分率， 发现由活化γδ T细胞和成熟DC作为抗原提呈细胞的二组， 培养到晚期时增殖的细胞绝大多数均是集中在第9、 10代。说明引起CD4+T细胞增殖的能力几乎相同。这些结果表明， 用MtbHAg活化的γδ T细胞和成熟DC一样， 具有提呈可溶性抗原给初始T细胞， 引起CD4+T增殖的能力。这与 Brandes报道的用非肽类抗原刺激的γδ T细胞提呈可溶性抗原的结果相一致。

　　为了证实MtbHAg活化的γδ T细胞能摄入蛋白抗原， 本实验将活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg在37℃的条件下孵育， 流式细胞术检测显示γδ T细胞摄入SAg的能力随着时间的增加而增加（30 min 至 90 min）。同时， 在激光共聚焦显微镜下也观察到γδ T细胞能将抗原摄入胞内。

　　综上所述， 经MtbHAg活化γδ T细胞具有抗原提呈作用， 其功能活性似乎与成熟DC没有明显差别， 但γδ T细胞更容易获取和体外操作。因此， 这种活化的γδ T细胞可在制备疫苗和免疫治疗中成为新的目标［6］。

参考文献

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［2］ Chen ZW， Letvin NL. Adaptive immune response of Vγ9Vδ2T cells: a new paradigm［J］. Trends Immunol， 2003， 24(4): 213-219.

［3］ Brandes M， Willimann K， Moser B. Professional antigenpresentation function by human γδ T cells［J］. Science， 2005， 309(5732): 264-268.

［4］ 陈 勇， 吕合作， 胡建国， 等. 刺激人γδ T细胞增殖的结核杆菌多肽抗原的生物学特性分析［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2003， 19(2): 121-123.

［5］ Boom WH， Baiaji NK， Nayak R， et al. Characterization of a 10 to 14Kilodalton proteasesensitive Mycobacterium tuberculosis H37Ra antigen that stimulates human γδ T cells［J］. Infect Immun， 1994， 62(12): 5511-5518.