二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸对对模拟失重大鼠红细胞膜流动性的影响

　　　　　　 作者：郭凯， 胡华碧， 陈琳， 魏冀， 马慧

【摘要】 目的: 研究二十二碳六烯酸(DHA)、 二十碳五烯酸(EPA)对模拟失重大鼠红细胞膜流动性的影响。方法: 将30只健康SD大鼠随机分为地面对照组(Ⅰ)、 悬吊对照组(Ⅱ)和悬吊实验组(Ⅲ)。悬吊实验组鼠料中添加DHA、 EPA ， 其他2组为普通鼠料。悬挂40 d后利用激光衍射法测定红细胞变形指数、 取向指数， 荧光偏振法测定红细胞膜流动性， 硫代巴比妥酸荧光法测定红细胞膜脂质过氧化物(LP0)， 激光共聚焦显微镜观测红细胞纤维型肌动蛋白的改变及含量。结果: 失重下大鼠红细胞的变形指数、 取向指数以及红细胞膜的流动性明显降低( P&<0.05)， LPO增加， 红细胞形态和骨架发生改变， Factin含量明显降低(P&<0.05)。结论: 在模拟失重条件下， 红细胞膜流动性降低， DHA、 EPA可拮抗损伤作用， 对红细胞膜具有较强的保护作用。

【关键词】 二十二碳六烯酸; 二十碳五烯酸; 模拟失重; 红细胞膜; 膜流动性

二十二碳六烯酸(DHA) 、 二十碳五烯酸(EPA) 是n3多不饱和脂肪酸， 对于稳定细胞膜的结构和功能、 提高机体抗氧化能力有着十分重要的意义[1]。研究证明， 自由基可通过脂质过氧化引起生物膜质分子结构改变， 使生物膜流动性下降[2]。我们通过观察失重条件下大鼠红细胞膜流动性的改变， 探讨DHA、 EPA 对细胞膜流动性的影响， 证实多不饱和脂肪酸是否对微重力条件下的机体代谢有影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性SD大鼠30只， 体质量(160.6±9.8)g。购于贵阳医学院实验动物中心。DHA、 EPA 胶囊由威海达因海洋生物制药有限公司提供， 含量为450 mg/粒， 含DHA、 EPA 70%。每斤普通鼠料中加3粒DHA、 EPA胶囊。所有动物均饮普通自来水。LBYBX2型激光衍射仪(北京普利生仪器中心); Hitachi 850 型荧光分光光度计(日本日立公司); 激光扫描共聚焦显微镜(德国Leika 公司); GL16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。1， 5二苯基1， 3， 5己三烯(DPH， Fluka公司); 硫代巴比妥酸(德国Merk公司); 罗丹明标记的鬼笔环肽(Molecular Probes公司); Triton X100(美国Sigma公司); 聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP， MW=30kD， 德国进口分装); 150 g/L PVP溶液( PVP 15 g， Na2HPO4 284 mg， Kh3PO4 68 mg， NaCl 0.38 g， 溶于100 mL蒸馏水中， 用100 mL/L NaOH调pH值至7.4， 黏度为15 map·s， 300 mOsm) 。30 g/L PVP溶液( 150 g/L PVP溶液与等渗PBS溶液1∶4混合， 黏度1.02 map·s) 。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组 将以上动物随机分为3组， 每组10只: I组为地面正常对照组; Ⅱ组为悬吊对照组; Ⅲ组为悬吊实验组。采用尾部悬吊法模拟失重， 大鼠后肢离地， 躯干与地面成30°夹角， 前肢可自由活动。悬吊时间为40 d 。对照组饲正常鼠料， 实验组鼠料加DHA ， EPA。

　　1.2.2 血液流变学指标测定 取全血20 μL加入2.5 mL 150 g/L PVP溶液中， 用传统激光衍射法[3]在剪切率为50～1 000 s-1下， 利用LBYN6A型红细胞变形聚集仪测红细胞的变形指数( deformation index， DI) 和积分变形指数( integrated formation index， IDI); 取全血12.5 μL加入2.5 mL 30 g/L PVP溶液中， 用新型激光衍射法[3]在剪切率为50～150 s-1下， 用LBYBX2型激光衍射仪测红细胞的取向指数(orientation index， OI)。

　　1.2.3 红细胞膜流动性测定 取血后， 肝素抗凝， 离心， 取沉淀部分用低渗Tris缓冲液(10 mmol/L， pH 7.4) 破膜40 min， 25 000 r/min 4℃离心40 min去上清， 用低渗Tris 在上述离心条件下反复清洗沉淀物数遍， 直至变为乳白色， 再用90 g/L NaCl 于4℃， 50 000 r/min 离心60 min， 清洗沉淀物， 去除上清后， 得到红细胞血影。DPH溶解在四氢呋喃中配制成2×10-3 mol/L 储存液， 实验前用pH7.4， 0.01 mol/L PBS 稀释成2×10-6 mol/L应用液， 取已制备好的样品1 mL (蛋白含量0.3～0.6 g/L) 加入3 mL DPH应用液， 混匀， 25℃温育30 min ， 3 000 r/min， 离心10 min ， 用PBS洗1次， 最后悬浮于4 mL PBS中待测。荧光分光光度计光源150 W氢灯、 狭缝10 nm、 激发波长359 nm、 发射波长430 nm ， 在25℃下分别测定与激发光、 偏振光振动方向平行、 垂直时的荧光偏振强度， 然后按文献[4]中公式计算出P 值。再应用Einstein 硬粒子溶液粘度公式计算出膜的相对流动系数(MFU)[4]。

　　1.2.4 红细胞膜LPO含量测定 取红细胞膜悬液测定红细胞膜LPO含量[5]。

　　1.2.5 激光共聚焦显微镜观察红细胞骨架 离心收集2×106细胞， 用PBS洗2次(1 000 r/min， 5 min)， 弃上清。200 μL含37 g/L甲醛的PBS固定细胞， 室温放置15 min， 用PBS洗2次(1 000 r/min， 5 min)， 弃上清。用含1 g/L Triton X100的PBS悬浮细胞， 室温放置5 min。用PBS洗2次(1 000 r/min， 5 min)， 弃上清。将细胞重新悬浮在200 μL含10 g/L BSA的PBS中， 室温放置30 min， 用PBS洗两次(1 000 r/min， 5 min)， 弃上清。200 μL PBS重新悬浮细胞， 加入10 μL罗丹明标记的鬼笔环肽(200 μL/mL， 溶于甲醇中)， 混匀， 室温， 避光静止20 min。用PBS洗1次(1 000 r/min， 5 min)， 弃上清， 将细胞重悬在50 μL的PBS中， 在4℃避光保存样品。用双面胶在载玻片上做成井状的小室， 将细胞悬液滴加在小室内， 放盖玻片， 在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架并检测其荧光强度[6]。

　　1.3 统计学分析 统计分析采用SPSS10.0软件。样本均数比较用t检验、 方差分析及q检验。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 红细胞DI、 IDI、 OI的改变 与Ⅰ组比较， Ⅱ组大鼠红细胞DI 、 IDI 、 OI的变化没有统计学差异(P&>0.05)， 而Ⅱ组与二者的差异明显(P&<0.05， 图1)。

　　2.2 红细胞膜流动性测定 与Ⅱ组相比， 悬吊实验组红细胞膜偏振度(polarigatis， P)显著减小， MFU显著增大， 红细胞膜LPO相对减少(P&<0.05)， 表明实验组红细胞膜流动性显著大于悬吊对照组， 红细胞膜流动性的增加与LPO的减小有关， 与地面对照组之间无统计学差异(表1)。表1 红细胞膜流动性测定结果

　　2.3 红细胞膜型肌动蛋白表达及含量 在正常生理状态下的红细胞骨架主要聚集在红细胞膜下， 荧光显微镜下可见膜下有一个明显环， 胞分布量很少。 Ⅱ组大鼠红细胞骨架的完整性明显破坏， 在膜下并未形成完整的环， 胞质含量增多， 并且分布不均匀(图2)。Ⅱ组大鼠红细胞的荧光强度显著降低(P&<0.05)。Ⅰ组的平均荧光强度为185±21， Ⅱ组为120±26， Ⅲ组为181±22， Ⅱ组与Ⅰ组、 Ⅲ组比较， 纤维型肌动蛋白的含量明显减少(P&<0.05)。图2 大鼠红细胞骨架激光共聚焦扫描图像(×400)

　　A: Ⅰ; B: Ⅱ; C: Ⅲ.

　　3 讨论

　　细胞膜的正常功能有赖于膜结构的完整和膜质的恒定流动[7]， 细胞膜质流动性是细胞膜的主要动力学特性。许多资料说明， 膜的这种特性与细胞发育、 分化、 增殖、 免疫反应和信息传递等生物学基本功能密切相关。失重条件下， 机体发生一系列生理生化改变， 脂质过氧化作用增强[8]， 动脉粥样硬化作用增强、 冠心病指数升高， 发生心血管疾病的危险加大。通过检测红细胞的变形指数和取向指数， 发现悬吊对照组大鼠红细胞变形能力明显下降(P&<0.05)。由于膜流动性是决定红细胞变形的因素之一， 为探讨红细胞变形能力下降机制， 我们进一步检测了红细胞膜的流动性。由红细胞膜荧光偏振度计算膜相对流动系数， 细胞氧化损伤越严重， 则膜相对流动系数越小， 流动性越差。与地面对照组相比较， 悬吊对照组的MFU显著的减小， 减小达64.7% ， 显示模拟失重条件会造成显著的膜流动性降低。而地面对照组和悬吊实验组无统计学差异。实验结果显示， 添加DHA、 EPA可以显著的改善模拟失重对大鼠细胞膜MFU的减小影响， 即能够增强模拟失重条件下细胞膜的流动性， 并调节使之达到与正常对照相当的水平。对细胞功能的正常发挥有着显著的良好效果。红细胞骨架也是决定红细胞变形的一个主要因素[6]。细胞骨架包括微丝、 微管和中等纤维， 在红细胞其主要聚集在红细胞内表面， 在胞质含量较少。我们采用鬼笔环肽标记的罗丹明对纤维型肌动蛋白进行标记。通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行观察， 结果发现， 悬吊对照组大鼠红细胞纤维型肌动蛋白呈解聚状态， 纤维型肌动蛋白在红细胞胞质中分布增多; 通过检测荧光强度发现在尾悬吊对照组大鼠红细胞中纤维型肌动蛋白的含量显著降低(P&<0.05)。这说明悬吊状态下对红细胞骨架结构亦具有一定的影响。而流行病学研究和动物实验证实: 进入机体的DHA、 EPA主要储存于脑、 肝脏、 红细胞和血浆中， 而且DHA、 EPA优先掺入到细胞膜中[10]。构成细胞的磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂中均有大量烯烃结构， 具有大量不饱和键， 所以对自由基尤其是氧自由基非常敏感， 而DHA、 EPA的掺入可以保护细胞膜内的不饱和键， 使其不被氧化， 从而维持细胞膜的正常功能[4]。临床研究证实， DHA和EPA具有减轻脂质过氧化损伤等作用[7]。本次实验， 也再一次证实了DHA、 EPA对红细胞膜的保护作用， 这种作用的发挥可能与DHA、 EPA上述的生物学效应有关。

参考文献

　　[1] 鲍建民. 多不饱和脂肪酸的生理功能及安全性[J]. 中国食品与营养， 2006， 1(1): 45-47.

　　[2] 胡大林. 自由基与DN A氧化损伤[J]. 国外医学·卫生学分册， 2002， 29(5): 261-263.

　　[3] Wen ZY， Yan ZY， Tao T， et al. A Study of the BiophysicalMeanings of Orientation and Deformation of Rbcs in Shear Flow Field of Low Viscosity with New Ektacytometry[J]. Sci Chin(Series C)， 1998， 41: 195-202.

　　[4] 于得庆.DHA和EPAD对耐力训练小鼠红细胞膜流动性影响的实验研究[J]. 河北科技大学学报， 2005， 26(1): 31-34.

　　[5] 赵南明， 周海梦. 生物物理学[M]. 北京: 高等教育出版社， 2000: 140.

　　[6] 王现伟. 激光生物学技术研究高脂血症大鼠红细胞变形能力改变及其机制[J]. 激光生物学报， 2007， 16: 149-151.

　　[7] 程 时. 生物膜与医学[M]. 3版， 北京: 北京医科大学出版社， 2004: 53.

　　[8] 汤 宁. 食物脂肪对大鼠脑、 肝、 肾组织中脂质过氧化作用的影响[J]. 环境与健康杂志， 2005， 22(1): 23-25.

　　[9] 李 亚. 衰老及促智药影响神经细胞膜流动性机制的研究进展[J]. 动物学研究， 2005， 26(2): 220-224.

　　[10] 苏艳红. 不同磷脂补充对运动小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究[J]. 中国体育科技， 2009， 45(2): 120-124