Hax1 siRNA对黑素瘤A375细胞化疗敏感性的影响

　　　　 作者：李文彬 冯捷， 闫小宁， 张彩晴

【摘要】 目的: 探讨Hax1 siRNA对黑素瘤A375细胞化疗敏感性的影响。方法: MTT法、 AnnexinVFITC/PI染色、 Hoechst 33258染色、 Western blot检测Hax1 siRNA联合顺铂或苦参碱对细胞增殖、 凋亡和caspase3活性形式表达的影响。结果: 相同药物浓度作用下， Hax1 siRNA转染组细胞抑制率、 凋亡率及cleaved caspase3表达明显高于未转染组和转染无关载体组(P&< 0.05); 荧光显微镜下观察， 相同药物浓度作用下， Hax1 siRNA转染组细胞凋亡现象较明显。结论: Hax1 siRNA增强顺铂或苦参碱对黑素瘤A375细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用， 该作用可能和caspase3的活性形式表达增强相关。

【关键词】 siRNA; Hax1; 黑素瘤; 化疗敏感性

　　[Abstract] AIM: To investigate the effects of Hax1 siRNA on sensitivity to chemotherapy of melanoma A375 cells. METHODS: The effects of Hax1 siRNA combined with cisplatin(DDP) or Matrine(Mat) on proliferation， apoptosis of A375 cells and active forms of caspase3 were detected with MTT assay， Annexin VFITC/PI staining with FCM， Hoechst 33258 staining， and Western blot respectively. RESULTS: The inhibition of proliferation ， induction of apoptosis and the expression of active caspase3 forms in DDP or Mat treated A375 cells transfected with Hax1 siRNA were all significantly higher than those in untransfected A375 cells or A375 cells transfected with control siRNA (P&<0.05). The distinctive apoptotic morphology was observed in Mat or DDP treated A375 cells transfected with Hax1 siRNA. CONCLUSION: The data from our current study indicate that Hax1 siRNA could enhance the effects of DDP or Mat on inhibition of melanoma A375 cell growth and induction apoptosis， which may be caused by the increased expression of active forms of caspase3.

　　[Keywords]siRNA; Hax1; melanoma; chemotherapy sensitivity

黑素瘤病程中晚期或具有高危因素的早期病变应予以全身辅助化学治疗， 但临床资料显示黑素瘤细胞对化疗药物相对不敏感， 且化疗的毒副作用大， 患者难以耐受， 常常导致治疗的失败。凋亡抑制是肿瘤对化疗药物产生耐药的原因之一， 增加肿瘤细胞对化疗药物诱导凋亡的敏感性从而逆转肿瘤化疗耐药， 是目前逆转肿瘤耐药的手段之一。Hax1是近年发现的一个凋亡抑制蛋白[1]。我们前期研究已证实， 通过RNAi技术下调基因Hax1能明显诱导A375细胞发生凋亡， 并抑制细胞的增殖[2]。本研究探讨Hax1是否和肿瘤对化疗药物的耐药有关， 观察了Hax1 siRNA转染后， 顺铂、 苦参碱对A375细胞作用的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 恶性黑素瘤细胞株A375细胞由西安交通大学第二医院皮肤科保存。DMEM培养基购自美国Invitrogen公司; 胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程公司; 载体pSUPER.puro购自美国Oligoengine公司; LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen 公司; 四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司; Annexin VFITC细胞凋亡试剂盒购自晶美生物工程有限公司; 兔抗caspase3抗体、 HRP标记羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司; ECL化学发光显色剂购自美国Roche公司; Hoechst 33258购自碧云天生物技术公司; 顺铂(cisplatin， DDP)购自山东齐鲁制药厂; 苦参碱(Matrine， Mat)购自广东明兴药业。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pSUPER.purosiRNA质粒表达载体构建和转染 pSUPER.purosiRNA质粒表达载体的构建、 转染方法同我们最近的报道[2]， 成功构建的载体为pSUPERsiH1， 其对Hax1 mRNA和蛋白表达的抑制率为66.7%和75.8%; pSUPERC(无关对照载体)。

　　1.2.2 细胞培养 恶性黑素瘤细胞株A375细胞用含100 mL/L 胎牛血清DMEM培养液(加入青霉素、 链霉素各10万单位)， 置于37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养。

　　1.2.3 MTT法检测 (1)MTT法检测Mat、 DDP对A375细胞增殖的影响: A375细胞以3×103个/孔， 接种于96孔培养板， 24 h后各组分别加入100、 200、 400、 800、 1 600 mg/L的Mat或0.5、 1、 2、 4、 8 mg/L的DDP， 每孔终末体积为200 μL， 对照组加等量的培养液， 每组设3个复孔; 于24 h、 48 h、 72 h每孔加入MTT液(5 g/L)20 μL， 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱继续培养4 h; 弃培养液， 每孔加入DMSO 150 μL， 室温下振荡5 min， 静置10 min; 酶标仪490 nm处测定吸光度A值， 细胞增殖抑制率=(对照组A值-处理组A值)/对照组A值×100%， 绘制细胞生长曲线。(2)MTT法检测Hax1 siRNA对DDP、 Mat抑制A375细胞增殖的影响: 未转染A375细胞、 pSUPERC及pSUPERsiH1转染组细胞以3×103个/孔， 接种于96孔培养板， 每组设3个复孔。4 h后， 在pSUPERC组、 pSUPERsiH1转染组及未转染A375细胞组中加入Mat或DDP， 设为Mat组、 Mat+pSUPERC组、 Mat+pSUPERsiH1组、 DDP组、 DDP+pSUPERC组、 DDP+pSUPERsiH1组; 药物作用浓度的选择为IC50浓度(Mat为754.2 mg/L; DDP为3.4 mg/L); 于72 h每孔加入新配制MTT液(5 g/L)20 μL， 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱继续培养4 h; 余步骤同前。

　　1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞， 4℃预冷的PBS洗涤2次， 用250 μL结合缓冲液(pH7.5 100 mmol/L Hepes、 1.4 mmol/L NaCl、 25 mmol/L CaCl2)重悬细胞， 调整其密度为1×109/L; 取100 μL的细胞悬液于5 mL Falcon管中， 加入5 μL Annexin V/FITC 和 10 μL的碘化丙锭(PI)溶液(20 mg/L); 混匀， 室温避光放置15 min; 各管中加入400 μL PBS; 流式细胞术检测分析。

　　1.2.5 Hoechst 33258染色 将洁净盖玻片置于6孔板内， 然后在6孔板内按1×103细胞/孔接种A375细胞; 待长满孔底的70%～80%时， 吸尽培养液， 加0.5 mL固定液， 10 min后用PBS洗2遍， 吸尽液体。加0.5 mL染色液， 5 min后用PBS洗2遍， 吸尽液体。滴加抗荧光淬灭封片液于载玻片上， 盖上贴有细胞的盖玻片， 荧光显微镜下观察并照相。

　　1.2.6 Western blot检测caspase3蛋白的表达 收集细胞， PBS冲洗2次， 吸尽液体， 加细胞裂解液200 μL， 冰上放置10 min， 刮下裂解物， 吸入1.5 mL Eppendorf管中， 室温振荡、 冰上放置10 min， 4℃、 12 000 r/min离心15 min; 上清即为细胞总蛋白。蛋白定量后， 取20 μg样品， 用120 g/L SDSPAGE进行电泳分离后转移到PVDF膜， 置于含50 g/L脱脂牛奶的TBST溶液中4℃封闭过夜， 洗膜， 加入cleaved caspase3(1∶1 000)的抗体4℃孵育过夜， 经TBST充分漂洗后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。βactin抗体作为上样量的内参。暗室内ECL发光检测。

　　1.2.7 统计学分析 应用SPSS 10.0软件进行数据分析; 结果以x±s表示， 计量资料采用t检验、 ANOVA， 计数资料采用χ2检验; P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Mat、 DDP对A375细胞增殖的影响 MTT检测绘制生长曲线显示， 72 h时不同浓度的Mat均可抑制A375细胞的增殖， 和对照组相比， 有统计学意义(P&<0.05)， 最大增殖抑制率可达67.6%(图1A); 不同浓度的DDP均可抑制A375细胞的增殖， 和对照组相比， 有统计学意义(P&<0.05)， 最大增殖抑制率可达85.3%(图1B)。采用改良寇式法[3]计算Mat作用A375细胞72 h后的IC50为754.2 mg/L; DDP作用A375细胞72 h后的IC50为3.4 mg/L。

　　图1 Mat和DDP对A375细胞增殖的影响(aP&<0.05 vs对照组)

　　2.2 Hax1 siRNA对Mat、 DDP抑制A375细胞增殖作用的影响 为研究Hax1 siRNA对Mat、 DDP抑制A375细胞增殖作用的影响， 对72 h各组细胞的增殖进行MTT检测， 结果如图2显示， 各组的增殖抑制率分别为: pSUPERC(4.1%)、 pSUPERsiH1(32.1%)、 Mat(51.1%)、 Mat + pSUPERC组(52.5%)、 Mat+pSUPERsiH1(66.7%)、 DDP(50.4%)、 DDP+pSUPERC(49.3%)、 DDP+pSUPERsiH1(82.6%); 与pSUPERC组相比， 其余各组均能抑制细胞增殖(P&<0.05)。Mat+pSUPERsiH1组与Mat组、 pSUPERsiH1组相比较， 细胞增殖抑制率升高(P&<0.05); Mat+pSUPERC组与Mat组比较无统计学意义。DDP+pSUPERsiH1组与DDP组、 pSUPERsiH1组相比较， 细胞增殖抑制率升高(P&<0.05); DDP+pSUPERC组与DDP组比较无统计学意义。提示， Hax1siRNA可以增加A375细胞对化疗药物DDP、 Mat抑制细胞增殖的作用。

　　2.3 Hax1siRNA对DDP、 Mat诱导A375细胞凋亡作用的影响 AnnexinV/PI法检测结果显示(图3、 4)， 各组细胞的早期凋亡率分别约为: 未转染组(3.2%)、 pSUPERC(4.6%)、 pSUPERsiH1(15.1%)、 Mat(12.9%)、 Mat+pSUPERC组(13.5%)、 Mat+pSUPERsiH1(22.2%)、 DDP(19.7%)、 DDP+pSUPERC(18.5%)、 DDP+pSUPERsiH1(28.6%); 与pSUPERC组相比， 其余各组细胞凋亡率均升高(P&<0.05)。与Mat组、 pSUPERsiH1组相比较， Mat+pSUPERsiH1组细胞凋亡率升高(P&<0.05); Mat+pSUPERC组与Mat组比较无统计学意义。与DDP组、 pSUPERsiH1组相比较DDP+pSUPERsiH1组细胞的凋亡率升高(P&<0.05); pSUPERC组与未转染组相比无统计学意义; DDP+pSUPERC组与DDP组比较无统计学意义。提示， Hax1siRNA可以增加A375细胞对化疗药物Mat、 DDP诱导凋亡的敏感性。图2 各组细胞增殖抑制率

　　1: pSUPERC; 2: pSUPERsiH1; 3: Mat; 4: Mat+pSUPERC; 5: Mat+pSUPERsiH1; 6: DDP; 7: DDP+pSUPERC; 8: DDP+pSUPERsiH1. aP&<0.05 vs pSUPERC; bP&<0.05 vs pSUPERsiH1; cP&<0.05 vs Mat组; dP&<0.05 vs DDP组.

　　2.4 细胞凋亡形态的检测 Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察可见未转染细胞核呈均一的蓝色; 转染pSUPERsiH1组、 Mat组、 Mat+pSUPERsiH1组、 DDP组、 DDP+pSUPERsiH1组细胞均出现细胞核呈致密浓染， 或呈碎块状致密浓染， 其中Mat+pSUPERsiH1组和DDP+pSUPERsiH1组凋亡细胞较明显(图4)。

　　2.5 Hax1siRNA联合Mat或DDP 对caspase3蛋白活性表达的影响 Caspase3是细胞凋亡的重要标志， 激活形式为cleaved caspase3。采用Western blot方法检测了各实验组细胞cleaved caspase3的表达， 结果显示各条带与内参βactin蛋白条带光密度校正分析后表明， 与pSUPERC组相比， pSUPERsiH1组、 Mat组、 Mat+pSUPERC组、 Mat+pSUPERsiH1组细胞cleaved caspase3表达均升高(P&<0.05); 与Mat组、 pSUPERsiH1组相比较， Mat+pSUPERsiH1组细胞cleaved caspase3表达升高(P&<0.05); Mat+pSUPERC组与Mat组比较无统计学意义; pSUPERC组与未转染组相比无统计学意义(图5)。与pSUPERC组相比， pSUPERsiH1组、 DDP组、 DDP+pSUPERC组、 DDP+pSUPERsiH1组细胞cleaved caspase3表达均升高(P&<0.05); 与DDP组、 pSUPERsiH1组相比较， DDP+pSUPERsiH1组细胞cleaved caspase3表达升高(P&<0.05); DDP组与DDP+pSUPERC组比较无统计学意义; pSUPERC组与未转染组比较无统计学意义(图6)。该结果从蛋白水平进一步表明Hax1 siRNA联合DDP或Mat是通过激活caspase3来诱导细胞凋亡。

　　3 讨论

　　化疗是治疗肿瘤主要手段之一。长期使用化疗药物后肿瘤细胞往往会表现出对化疗药物的耐药[4]。随着肿瘤发生机制研究的深入， 人们认识到凋亡抑制是肿瘤耐药的主要原因， 许多与凋亡有关的基因如bcl2、 raf1、 p53、 NFKB， 它们的表达产物可阻断或阻碍多种因素如化疗、 射线、 糖皮质激素等诱导的细胞凋亡[5]。

　　黑素瘤是一个恶性程度较高的肿瘤， 因其自发凋亡水平较低和凋亡不足， 导致对临床上使用的化疗药物表现明显的耐受。顺铂通过损伤细胞DNA杀伤肿瘤细胞， 但由于易产生化疗耐药导致疗效不佳。苦参碱是从豆科植物中分离出的生物碱， 对多种肿瘤细胞有抑制增殖、 诱导凋亡的作用[6， 7]。我们既往研究已证实Hax1在黑素瘤A375细胞中呈高表达并抑制凋亡。为探讨黑素瘤细胞中Hax1的高表达是否和黑素瘤细胞对抗肿瘤药物的抵抗相关， 我们选择顺铂和苦参碱的IC50浓度作用于Hax1siRNA后的A375细胞， 发现和单独使用顺铂或苦参碱相比较， Hax1 siRNA与顺铂或苦参碱联合用药能明显抑制肿瘤细胞的增殖。提示， Hax1基因表达下调可以增加黑素瘤A375细胞对顺铂、 苦参碱抑制增殖的敏感性。进一步观察发现Hax1 siRNA与顺铂或苦参碱联合用药比单独使用顺铂或苦参碱能明显增加细胞的凋亡。同时对实验各组细胞进行了Hoechst 33258染色， 荧光显微镜下发现Hax1siRNA与顺铂或苦参碱联合用药组， 出现核浓缩， 核碎裂等典型凋亡形态的细胞数明显增多， 提示Hax1基因表达下调可以增加黑素瘤A375细胞对顺铂、 苦参碱诱导凋亡的敏感性。因此， 我们推测Hax1对凋亡的抑制可能是导致黑素瘤化疗耐药的又一因素， 该结果与许多学者研究发现的凋亡抑制基因如bcl2、 BclxL、 XIAP的异常表达与黑素瘤化疗耐药机制相关的结果相似[8， 9]。

　　众所周知， 利用诱导凋亡已成为癌症化学治疗的一种策略， 不同肿瘤细胞对化疗药物敏感性的差异， 主要是因各种肿瘤细胞凋亡阈值的不同， 肿瘤细胞对化疗耐药的实质是其凋亡途径不能被活化[10]。化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的中心环节是caspases的激活， 各种原因导致的肿瘤细胞caspases活性抑制或活性不足是肿瘤耐药的主要原因[11]。本研究显示， Hax1siRNA和顺铂或苦参碱联合用药能明显增加caspases3活性蛋白的表达， 提示Hax1 siRNA增加顺铂或苦参碱对肿瘤细胞凋亡的诱导是通过激活caspases3来实现的。因此， 本研究的结果提示Hax1基因可作为逆转黑色瘤细胞化疗耐药的新靶点， 对于其具体作用机制还有待于深入研究。

参考文献

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