CD80人鼠嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用

　　作者：王艳茹， 马泓冰， 陈永井， 朱华亭， 刘玉华， 杜阳阳， 孙杰， 陈明心， 邱玉华

【摘要】 目的: 研究CD80人-鼠嵌合抗体（命名为ch4E5）对天然高表达CD80分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用。方法: 采用免疫荧光及流式细胞术（FCM）分析ch4E5对Raji及Daudi细胞膜型CD80分子的识别; 将ch4E5分别加入到Raji及Daudi中共培养， 终浓度为10 mg/L。在培养的第0、 4、 10、 16、 24及48 h， 采用FCM检测细胞表面Fas及FasL的表达; 培养至72 h， MTT法检测细胞的增殖; 以人外周血PBMC为效应细胞， Raji与Daudi为靶细胞， 效靶比为20∶1， 加入ch4E5， 终浓度为10 mg/L。培养至24 h， MTT法分析ADCC效应。结果: ch4E5与Raji及Daudi的阳性结合率分别为98.6%和96.4%。ch4E5分别与Raji及Daudi共培养至4 h， Raji细胞表面FasL的表达开始上调， 16 h的阳性表达率为16.8％， 与人IgG1对照组1.5%比较明显升高(P&<0.01); Fas的表达从10 h起逐渐增高， 24 h达高峰， 阳性表达率为15.6％， 与人IgG1对照组4.5%比较具有统计学意义(P&<0.01)。Daudi的FasL及Fas的变化趋势与Raji一致。ch4E5分别与Raji及Daudi共培养至72 h， 细胞增殖的抑制率分别为34.60％和32.64％（P&<0.01）; ch4E5介导PBMC对Raji及Daudi的杀伤率分别为55.61％及54.42％（P&<0.01）。结论: CD80人－鼠嵌合抗体能够通过其Fab段及Fc段发挥双重的抗肿瘤效应。

【关键词】 CD80; 嵌合抗体; 抑制作用; Fas; FasL; ADCC

　　［Abstract］ AIM: To study the inhibitory and lethal effects of humanmouse chimeric antibody against CD80 (named ch4E5) on the growth of B lymphoma cell lines Daudi and Raji. METHODS: Immunofluorescence and flow cytometry were used to analyze the detection of membrane CD80 in Raji and Daudi by ch4E5. After the coculture of ch4E5 with Raji and Daudi， respectively， at the final concentration of 10 mg/L， the expression of Fas and FasL was observated to be at the 0 h， 4 h， 10 h， 16 h， 24 h and 48 h by direct immunofluorescence and flow cytometry， and the blocking effect on cell growth of ch4E5 was determined at 72 h by MTT assay. MTT assay was also used to study the ADCC effect with PBMC as effector cells and Raji and Daudi as target cells. The efficiency target ratio was 20∶1. RESULTS: The combination rate between ch4E5 and Raji and Daudi was 98.6% and 96.4%， respectively. After the coculture of ch4E5 with Raji and Daudi cells for 4 hs， the expression of FasL in Raji began to upregulate. It reached the peak at 16 h and its positive rate was 16.8%. Compared with human IgG1 control group， it was increased obviously (P&<0.01). The expression of Fas increased at 10 h， and then reached the top at 24 h. The combination rate was 15.6%. There was significant deviation compared with human IgG1 control group (P&<0.01). Moreover， the expression of FasL and Fas on Daudi was also altered. The trend was similar to these on Raji， and the highest expression was 15.9% and 13.7%， respectively. The inhibitory rate was 34.60% and 32.64% respectively when ch4E5 with Raji and Daudi had been cocultured for 72 h (P&<0.01). Furthermore， ch4E5 could mediate the ADCC effect and the maximum killing rate was 55.61% and 54.42%， respectively(P&<0.01). CONCLUSION: The humanmouse chimeric antibody against CD80 can inhibit the proliferation of B lymphoma cell lines Daudi and Raji cells through Fab and Fc sections in vitro.

　　［Keywords］CD80; chimeric antibody; inhibitory action; Fas; FasL; ADCC

CD80是表达于抗原提呈细胞表面(antigenpresenting cell， APC) 的重要协同刺激分子， 其相应的受体是表达在T细胞表面的CD28家族分子。CD80与CD28结合转导T细胞活化所需的协同刺激信号［1］， 参与T细胞的免疫应答及免疫调节［2， 3］。随着研究的深入， 发现CD80分子在多种B系肿瘤细胞中均异常高表达［4］， 且该分子介导的信号与肿瘤细胞的恶性增殖及转移相关。运用基因工程技术制备的人－鼠嵌合抗体， 一方面可发挥鼠源性抗体Fab段高亲和力结合抗原的特性; 另一方面， 可通过人IgFc段介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity， ADCC）［5］、 补体依赖性细胞毒作用（complementdependent cytotoxicity， CDC）［6］及免疫调理作用等。本研究以天然高表达CD80分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi为分析对象， 运用自行研制的CD80人－鼠嵌合抗体， 观察和分析了其对Raji与Daudi细胞体外生长的抑制与杀伤效应。

1 材料和方法

　　1.1 材料 DMEM及RPMI1640培养基购自美国Gibco公司， 胎牛血清（FCS）购自美国Hyclone公司， 四氮唑盐（MTT）购自美国Sigma公司， 肝素抗凝健康人外周血由苏州市中心血库提供， antiFasFITC及antiFasLFITC购自北京博奥森生物技术有限公司， Ficoll为上海生化试剂二厂产品、 羊抗人IgG (Fc)FITC及羊抗鼠FITC购自联科生物技术有限公司， 550酶标仪购自美国Biorad公司， 流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司， Protein G亲和层析柱购自瑞典Pharmacia公司。分泌抗人CD80人鼠嵌合抗体的CHO细胞株ch4E5［7］， 分泌鼠抗人CD80单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株4E5［8］， 人CD80基因转染细胞株L929B71由本室建株并保存［8］， 人恶性B淋巴瘤细胞株Raji和Daudi及人T淋巴瘤细胞株Jurkat购自美国ATCC公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ch4E5的制备 将自行构建的分泌嵌合抗体的CHO细胞经大规模无血清培养， 收集上清， 经高速离心、 超滤浓缩及PBS透析过夜， 按Phamacia公司提供的方案， 采用Protein G亲和层析柱分离纯化， Lowry法定量， 纯品过滤除菌， 分装， 于-80℃保存备用。

　　1.2.2 ch4E5 对Raji及Daudi细胞膜型CD80分子的识别 收集生长良好的Raji及Daudi细胞， 经PBS洗涤后， 置于流式分析管中， 5×105/(30 μL·管)， 加入ch4E5， 1 μg/(20 μL·管)。于4℃反应45 min， PBS充分洗涤， 加入羊抗人IgG (Fc)FITC二抗， 4℃反应40 min， 充分洗涤后， 重悬细胞经FCM检测。同时设置L929B71、 Jurkat分别为阳、 阴性细胞对照， 以及鼠源性亲本抗体4E5对照。

　　1.2.3 ch4E5对Raji及Daudi体外增殖的影响 将Raji和Daudi用含50 mL/L FCS的RPMI1640调整细胞密度为1×109/L， 100 μL/孔置于96孔培养板中， 分别加入终浓度为10 mg/L的ch4E5， 37℃、 50 mL/L CO2培养72 h， 每孔加入MTT（5 g/L）10 μL， 继续培养4 h， 再加入50 μL DMSO， 37℃， 50 mL/L CO2孵育10 min， 570 nm处测定A值， 绘制生长曲线。每组设置3个复孔， 同时设置4E5及人IgG1(HuIgG1)同型对照组， 并计算抑制率。抑制率＝（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%。

　　1.2.4 ch4E5诱导Raji及Daudi凋亡的分析 将生长良好的Raji与Daudi细胞置于96孔培养板中， 以5×105/(100 μL·孔)， 同时加入终浓度为10 mg/L的ch4E5， 分别于培养0、 4、 10、 16、 24及48 h收集细胞， 分于流式分析管中， 经PBS充分洗涤后， 分别加入antiFasFITC及antiFasLFITC直标mAb(10 μL/管)， 4℃反应45 min， 再用PBS洗涤2遍， 经FCM分析。同时设置4E5及HuIgG1对照组。

　　1.2.5 ch4E5介导的ADCC效应的分析 采用Ficoll法分离肝素抗凝的健康人外周血单个核细胞（PBMC）为效应细胞， 按效靶比例20∶1将PBMC分别与Raji及Daudi细胞混合， 置于96孔培养板中， 效应细胞2×105/(50 μL·孔)， 靶细胞1×104/(50 μL·孔)， 加入ch4E5， 终浓度为10 mg/L。400 r/min离心3 min， 使效、 靶细胞充分接触。37℃、 50 mL/L CO2培养至24 h， 经MTT检测。每组设3个复孔， 同时设置4E5及HuIgG1对照组， 并计算杀伤率。杀伤率＝（1-实验组A值/对照组A值）×100%。

　　1.2.6 统计学分析 数据采用x±s表示， SPSS13.0软件包处理， t检验进行显著性分析。

2 结果

　　2.1 ch4E5对Raji及Daudi细胞膜型CD80分子的识别 经间接免疫荧光及FCM检测分析: ch4E5与Raji、 Daudi、 L929B71及Jurkat细胞的阳性结合率分别为98.6%、 96.4%、 98.8%及10.1%， 与亲本鼠源性抗体的结合率相当（图1）。

　　2.2 ch4E5对Raji及Daudi体外增殖的抑制作用 ch4E5分别与Raji及Daudi细胞共培养后， 逐日观察， 显微镜下可见细胞聚集成团， 胞质中出现黑颗粒， 折光性和立体感减弱。培养至72 h， MTT检测结果显示， ch4E5对Raji及Daudi体外增殖的抑制率分别为34.60％和32.64％。与HuIgG1同型对照组相比， 具有统计学意义（P&<0.01）。但ch4E5与鼠源性亲本抗体4E5之间无统计学意义（P&>0.05， 图2）。

　　2.3 ch4E5诱导Raji及Daudi的凋亡 ch4E5分别与Raji及Daudi共培养4 h起， Raji细胞表面FasL的表达开始上调， 培养至16 h达高峰， 阳性表达率为16.8%; Fas的表达从10 h起开始逐渐增高， 24 h达高峰， 表达率为15.6％; Daudi的FasL及Fas的阳性表达率分别为15.9％和13.7％。与HuIgG1同型对照组比较均具有统计学意义（P&<0.01）。但与鼠源性亲本抗体4E5比较无统计学意义（图3、 4）。 图2 ch4E5对Daudi及Raji细胞体外增殖的抑制作用

　　2.4 ch4E5介导的ADCC效应 经MTT检测， ch4E5介导PBMC对Raji及Daudi的杀伤率分别为55.61％及54.42％， 与HuIgG1同型对照组及鼠源性亲本抗体4E5之间均具有统计学意义（P&<0.01， 图5）。

　　3 讨论

　　基因工程技术改造的人－鼠嵌合抗体， 在保留鼠源性抗体高亲和力结合抗原的同时， 可通过人IgFc段介导ADCC、 CDC效应及免疫调理作用以增加抗体的生物学功能。本研究在成功构建了稳定分泌CD80人鼠嵌合抗体CHO表达体系的基础上， 经大规模无血清培养， 采用免疫亲和层析纯化， 获取嵌合抗体纯品。以天然高表达CD80分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi为研究对象， 对CD80人-鼠嵌合抗体ch4E5的生物学功能进行了系列的研究。

　　首先， 分析了获得的ch4E5纯品对不同细胞包括Raji、 Daudi、 L929B71及Jurkat表面CD80分子的结合。结果显示: ch4E5与其鼠源性亲本抗体4E5对CD80分子的阳性结合率相当。提示改造后嵌合抗体的空间构象并未影响其生物学功能， 仍对抗原具有较高的亲和力。为后续的研究及该抗体的临床应用开发奠定基础。ch4E5与天然高表达CD80分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi共培养72 h后， 能够明显抑制细胞的体外增值， 对Raji与Dandi的增殖抑制率分别为34.60％和32.64％， 与不含抗体的对照组相比明显升高（P&<0.01）。但嵌合及鼠源性亲本抗体之间无统计学意义。研究结果提示， Raji与Daudi表达的 CD80分子可能参与细胞的生长与增殖， 当抗原抗体结合产生交联时， 影响了肿瘤细胞表面膜受体的信号转导， 导致肿瘤细胞生长抑制。另一方面， 由于抗体的封闭及产生的空间位阻， 影响了肿瘤细胞的生长条件及生存状态， 而抑制其增殖。进而又检测了ch4E5分别与Raji及Dandi共培养后细胞表面Fas及FasL的表达情况。结果发现， ch4E5能够上调Fas及FasL的表达， 与不含抗体的对照组相比有明显的统计学意义。由于Fas及FasL的表达与细胞凋亡密切相关， ch4E5上调其表达， 增强了细胞对凋亡的敏感性。提示该抗体对CD80分子相关的肿瘤具有治疗效应。

　　对CD80人－鼠嵌合抗体Fc段功能的研究。本研究以健康人外周血PBMC为效应细胞。其中NK细胞及中性粒细胞等均含有Fc受体， 可介导ADCC效应。加入ch4E5共培养4、 8、 10、 16、 24及48 h。动态的检测结果显示， 在培养至24 h， 杀伤效应最为明显， 对Raji与Daudi的杀伤率分别为55.61％与54.42％。鼠源性亲本抗体4E5也能介导ADCC效应， 但与ch4E5相比， 其作用强度较弱且时间短暂。这一结果提示， 人Fc受体对鼠源性抗体的Fc段具有微弱的结合能力。而经基因工程技术改造后的嵌合抗体， 其结构中的人源IgFc段与人Fc受体可高亲和力结合， 介导高效的杀伤效应。在上述体外研究的基础上， 本课题组已运用CD80人－鼠嵌合抗体， 将Raji与Daudi细胞处理后移植入BALB/c裸鼠体内。迄今已观察45 d， 未见肿瘤形成， 而对照组成瘤率高达约80％（研究结果另文报道）。提示该嵌合抗体在体内、 外均具有良好的抗肿瘤效应。

　　基因工程技术改造的嵌合抗体， 其结构中的Fab段与Fc段可发挥协同作用。从而增强抗体的生物学功能。与此同时， 嵌合抗体中鼠源蛋白的含量约减少65%～70%。因此， 其免疫原性大大降低［9］。体内应用后， 抗鼠抗体（human antimouse antibody， HAMA）的产生减少［10］， 且体内半衰期明显延长， 可由鼠源抗体的约1.5 d延长至约10 d。进入临床应用后可明显减少给药剂量和给药次数， 减轻副作用的发生， 同时降低患者的经济负担。因此， 该类基因工程抗体具有良好的应用前景。

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