超抗原SEB 活化的NKT 细胞亚群形态和分化途径的研究

【摘要】 目的: 以NKT细胞形态和分化途径为焦点， 研究超抗原SEB活化的NKT 细胞亚群的特征。方法: C57BL/J小鼠脾细胞分别经SEB或者ConA诱导， 收集体外扩增10 d 和5 d的淋巴细胞以及获取正常黏附性巨噬细胞。用荧光抗体染色， 流式细胞仪测定淋巴细胞和大淋巴细胞群表面CD69的表达、 NKT细胞亚群百分数和不同NKT 细胞亚群的分化途径。倒置显微镜400倍下比较大淋巴细胞的形态。结果: SEB活化的淋巴细胞和大淋巴细胞表面CD69分子表达由正常值的0.11%分别提高到55.00%和68.95%。大细胞群中CD8+ 和TCRVB8+NKT 细胞亚群的百分数由原始的0.36%和0.81%分别提高到30.29%和31.48%。这些细胞位于流式细胞图的上部， 是大体积细胞群。显微镜下显示SEB活化的大淋巴细胞体积不仅大于ConA活化的T淋巴细胞， 而且比正常巨噬细胞大5倍以上， 是非黏附性细胞。胞内质粒松散、 胞质与核之比＞1。SEB活化的CD8+ 和TCRVβ8+NKT细胞亚群均由T细胞直接分化而来。结论: SEB活化10 d的NKT细胞亚群主要是CD8+ NK1.1+和TCRVβ8+ NK1.1+的NKT细胞。这些细胞是大体积淋巴细胞， 应属于T细胞的亚群。

【关键词】 NKT细胞亚群; 超抗原; 细胞形态; 细胞分化

　　［Abstract］ AIM: This study is to explore the biological characteristics of NKT subsets through investigating their morphology and differentiation pathways. METHODS: Splenic lymphocytes from C57BL/J mice were treated with either Staphylococcal entertoxin B (SEB) or ConA and then cultured in vitro. On day 5 and day 10， the lymphocytes were harvested. Normal adherent macrophages and normal lymphocytes were harvested on day 0. Expression of CD69 molecule on the cell surfaces of the lymphocytes and large lymphocytes by SEBactivated was measured using staining of fluorescent antibody and flow cytometry (FACS). And the percent (%) of NKT subsets was determined and analyzed the differentiation pathways of the NKT subsets. Appearance of subsets was observed and compared under a light microscope at ×400 magnification. RESULTS: Expression levels of CD69 molecule on the SEBactivated lymphocytes and the giant lymphocytes were significantly increased to 55% and 68.95% respectively as compared to the level (0.11%) detected on the normal lymphocytes (both P&<0.01; n=3). The percent (%) of CD8+NK1.1+ and TcRVβ8+NK1.1+ NKT subsets in the giant lymphocytes was significantly enhanced to 30.29% and 31.48% (84.0 or 38.9 folds) originally from 0.36% and 0.81%， respectively. Based on the cell distribution shown in the upper part of the FACS picture， they should be largescale selection. The SEBactivated lymphocytes in size were larger than not only the ConAactivated cells but also the adherent macrophages with an increase of 5 fold observed under a microscope. They are noadherent cells. There were a few granule seen in cytoplasm . The value of cytoplasm vs nuclei was less than 1.0. The SEBactivating CD8+ and TcRVβ8+NKT subsets were not relative to a NK source. They were produced directly from T cells differentiation. CONCLUSION: The SEBactivating NKT cells are giant lymphocytes in size， consisting predominantly of CD8+NK1.1+ NKT cells. They are considered as a subsets of T lymphocytes.

　　［Keywords］NKT cell subsets; superantigen; cellular morphology; cell differentiation

NKT细胞(nature killer T cell) 既表达T细胞受体TCR又表达NK细胞的表面标志CD161(NK1.1)， 最初被认定为第4类的淋巴细胞［1］。目前众多学者认为NKT细胞应属于T淋巴细胞亚群， 是T细胞在特殊状态或者活化状态下特殊的表达方式［2］。由于NKT细胞的活化以识别非多态性的CD1d分子递呈的糖脂类抗原为特征， 在很长的一段时间， 人们都认为能够活化NKT细胞的抗原仅限于αGalcer。随着研究的进展， 人们又发现了NKT细胞可能还有其他的抗原决定族（ligands）能够识别不同来源的脂类或者多肽类抗原而被活化［3］。到目前为止， 关于NKT细胞的分型、 分群和生物功能以及细胞的形态特征和器官来源等问题都不十分清楚。本研究中对多肽类抗原超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B， SEB)活化的NKT细胞亚群的形态和分化途径做初步研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 C57BL/J小鼠（雌性， 质量18～20 g， 8～10周龄）来自解放军总医院实验动物中心二级动物房。RPMI1640培养基购自Gibco公司， ConA购自Sigma公司， 胎牛血清购自天津市灏洋生物制品责任有限公司， IL2由北京四环生物制药有限公司购入; SEB（自主知识产权， 专利号: 00103991.4）; 抗CD3PerCP、 抗CD4FITC、 抗CD8PE、 抗NK1.1APC、 抗TcRVβ8PE和抗CD69FITC荧光抗体均购自BD公司。

　　1．2 方法

　　1．2．1 正常小鼠淋巴细胞制备 摘取C57BL/J小鼠脾细胞在无菌台前分离细胞， 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液， 经红细胞裂解， 洗涤2次后， 制备成密度为5×109/L个细胞的悬浮液待用。

　　1．2．2 SEB或ConA活化的淋巴细胞的制备 在25 mL培养瓶中加入3.5 mL 1×109细胞/L， 随后分别加入3.5 mL 400 μg/L SEB或者10 mg/L ConA， 混合后置37℃、 50 mL/L CO2孵箱培养10 d（第5天洗涤换液后细胞继续培养到第10天）和 5 d， 收获细胞， 作为待测NKT细胞。

　　1．2．3 巨噬细胞的制备 摘取C57BL/J小鼠脾细胞在无菌台中分离细胞， 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液， 经红细胞裂解液裂解， 洗涤2次后， 制备成密度为2×109/L个细胞。取10 mL置入直径玻璃平皿中， 37℃、 50 mL/L CO2孵箱中孵育2 h。去除上清液， 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液洗涤2～3次。黏附细胞为巨噬细胞， 用于与大细胞的形态比较 。

　　1．2．4 SEB活化的淋巴细胞和大细胞表面CD69的表达及NKT细胞亚群和分化途径的解析 在96孔板中加入5×105细胞/（100 μL/孔）， 加入0.1 mL SEB(400 μg/L) 在37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养。取培养第10天的细胞经抗CD3PerCP、 CD4FITC、 CD8PE和NK1.1APC以及CD3PerCP、 CD4FITC、 NK1.1APC和TcRVβ8PE荧光抗体四染色后， 和CD69PE染色后用流式细胞仪（FACs Calibue BD， USA）测定， 并分别记录大细胞群和淋巴细胞群中CD69表达百分数、 NKT细胞亚群百分数以及分化途径（P＜0.01， n=3）。

　　1．2．5 显微照相技术比较淋巴细胞和大细胞的形态 在400倍显微镜下比较正常淋巴细胞、 ConA活化5 d的淋巴细胞和SEB活化10 d 淋巴细胞体积形态。在400倍镜下与巨噬细胞做形态比较。

　　1．2．6 统计学分析 计量资料用x±s表示。采用t检验分析。所有数据均用CHISS统计软件处理。

2 结果

　　2．1 SEB活化的淋巴细胞和大细胞表面CD69分子表达 在流式细胞仪细胞分布图中获取正常C57小鼠淋巴细胞（Control）和分别获取经SEB活化10 d的淋巴细胞群及大细胞群(图1中， SEB10 d细胞图中的1和2)， 经流式细胞仪记录CD69表达的百分数（n=3）。正常小鼠脾细胞、 SEB活化10 d的淋巴细胞和大细胞表面CD69 表达的百分率分别为0.11%、 55.00%和68.95%（图1）。两群细胞均为活化细胞。

　　2．2 SEB活化的淋巴细胞和大淋巴细胞群中NKT细胞亚群的解析 用流式细胞仪解析了正常淋巴细胞和SEB活化10 d的淋巴细胞及大淋巴细胞群中NKT细胞亚群。表1显示与正常淋巴细胞相比， SEB活化10 d的淋巴细胞和大淋巴细胞中CD8+NKT细胞有明显增加。它们由原始的0.37%分别增加到8.91% （P＜0.05， n=3）和30.29%（P＜0.01， n=3）。 SEB活化的大淋巴细胞TcRVβ8+ NK1.1+NKT细胞也由原始的0.37%增加到31.48%（P＜0.01， n=3）。CD3+NK1.1+、 CD4+NK1.1+和CD4-CD8-/CD3+NK1.1+ NKT 细胞百分数没有显著性变化（P＞0.05， n=3）。表1 SEB活化的淋巴细胞和大细胞中NKT细胞亚群百分数

　　2．3 SEB活化的大淋巴细胞及其形态 在400倍显微镜下比较正常淋巴细胞、 ConA活化5 d的T淋巴细胞和SEB活化10 d 淋巴细胞体积和形态。结果显示正常淋巴细胞和ConA活化后的淋巴细胞个体大小均一， ConA活化后的T淋巴细胞体积大于正常淋巴细胞。SEB活化10 d的淋巴细胞中有大细胞存在， 其体积大于ConA活化后的T淋巴细胞（图2）。与正常的巨噬细胞相比， SEB活化的大淋巴细胞其体积大于巨噬细胞约5倍以上， 细胞内质粒松散， 胞质与核之比＞1（图3）。

　　2．4 SEB活化的NKT细胞亚群的分化途径 流式细胞仪显示SEB活化的NKT细胞主要是CD8+ 和TcRVβ8+ NKT 细胞亚群。它们均由T细胞分化而来（图4）。

3 讨论

　　NKT细胞属于免疫系统中的固有的受到遗传控制的细胞还是一过性起作用的细胞， 目前仍有争论。部分学者认为NKT细胞确实存在， 其数量也是稳定的， 但是在不同个体的人群中NKT细胞的数量差别很大， 能达到100倍以上［4］。NKT细胞在小鼠的组织中的分布是有规律的。在外周血和淋巴结中， NKT细胞占T淋巴细胞总数的0.5%， 肝脏中占到30%［5］。尽管有学者认为经典的NKT细胞应该是那些能够识别非多态性的CD1d分子递呈的糖脂类抗原αGalcer的TCRVα14+ NKT细胞（包括CD4+ NKT细胞和CD4-CD8-NKT细胞）， 即Ⅰ型NKT细胞。只有Ⅰ型NKT细胞才具有免疫调节功能［6， 7］。事实上， 到目前为止人们并不清楚NKT细胞究竟有多少型和多少群; 也不清楚具有功能的NKT细胞是否仅限于上述NKT细胞亚群以及它们是否与器官的来源有关。我们以往的研究发现除了αGalcer， 多太类抗原超抗原SEB也能诱导NKT细胞生成。活化后的NKT细胞显示出明显的耐受调节作用［8， 9］。本研究试图发现有耐受调节功能的NKT细胞亚群的形态和分化特征。实验测定了经SEB 活化10 d的淋巴细胞表面CD69分子表达率。CD69分子是淋巴细胞活化的早期标志， 包括活化的T细胞、 B细胞NK细胞以及NKT细胞。图1结果显示， CD69分子的表达率由静止状态的0.11%提高到55%。在那些细胞稀少的大细胞群中， CD69分子的表达率达到68.95%。用流式细胞技术解析了SEB活化的淋巴细胞亚群， 发现与糖脂类抗原αGalcer活化的NKT细胞不同的是， SEB活化的NKT细胞不是常规的CD4+ NKT细胞和CD4-CD8-NKT细胞， 而是CD8+ NKT细胞和TCRVβ8+ NK1.1+ 细胞。这些NKT细胞亚群主要存在于大淋巴细胞群中。因为正常小鼠的脾细胞中CD8+ NKT细胞和TCRVβ8+ NK1.1+ 细胞仅有0.37%和0.81%， 但是经SEB活化后的大淋巴细胞中CD8+ NKT细胞和TCRVβ8+ NK1.1+ NKT细胞数量达到了30.29%。和31.48%。这个百分率远远高于SEB活化的淋巴细胞群中的CD8+ NKT细胞（8.91%）和TCRVβ8+ NK1.1+ 细胞（7.71%）的数量（表1）。以正常淋巴细胞、 ConA 活化的T淋巴细胞以及正常的具有黏附性的巨噬细胞为对照， 比较了SEB活化后大淋巴细胞的体积。结果显示出SEB活化的淋巴细胞中分布大体积淋巴细胞。它们的体积远远大于ConA 活化的T淋巴细胞， 甚至比巨噬细胞大5倍之多。这些体积巨大的细胞不是巨噬细胞。它们是非黏附性细胞， 胞内质粒松散， 胞浆与细胞核之比＞1。尽管来自组织中的巨噬细胞其胞浆与核之比也＞1， 但是它们的体积仅比单核细胞大1～3倍， 并且具有黏附特征。SEB活化后的大细胞中CD8+ NKT细胞和TCRVβ8+ NK1.1+ NKT细胞数量分别从静止的0.37%和0.81%提高到30.29%和31.48%， 数量增加了80倍和37倍之多。这些细胞并不是由NK细胞和T细胞两着共同分化形成的， 而是由T细胞分化而来（图4）， 应属于T细胞的衍生细胞。上述结果暗示出SEB 活化的具有耐受调节功能的CD8+ NKT细胞和TCRVβ8+ NK1.1+ NKT细胞有可能是体积巨大的大淋巴细胞。

　　致谢: 感谢解放军总医院基础医学研究所实验仪器中心王珊技师在流式细胞测定方面给予的热情帮助; 感谢上述单位实验动物中心给予的帮助。

参考文献

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［3］ Zhou D， Mattner J， Cantu C， et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells［J］. Science， 2004， 306(11): 1786-1789.

［4］ Albert B， Paul B. Savage and Luc teyton the biology of NKT cells［J］. Annu Rev Immunol， 2007， 25(4): 297-336.

［5］ Van Rhijn I， Koets AP， Im JS， et al. The bovine CD1 family contains group 1 CD1 proteins but no functional CD1d［J］. J Immunol， 2006， 176(8): 4888-4893.

［6］ Joyee AG， Qiu H， Wang S， et al. Distinct NKT cell subsets are induced by different chlamydia species leading to differential adaptive immunity and host resistance to the infections［J］. J Immnol， 2007， 178(2): 1048-1058.

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［9］ 陈 钰， 钟 江， 徐 健 等. 超抗原SEB 活化的NKT 细胞亚群及耐受功能的研究［J］. 免疫学杂志， 2009， 25（1）: 23-26.