鼠抗人cKit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

　　　　作者：刘虹辰， 毛朝明， 苏晓瑜， 阮铮， 丁秋兰， 王学锋， 王鸿利， 奚晓东

【摘要】 目的: 鼠抗人cKit单克隆抗体（mAb）的研制及其生物学特性的鉴定。方法: 利用PCR技术获得人cKit的胞外免疫球蛋白区编码序列， 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30， 构建出重组表达质粒pQE30hKitD45。测序鉴定正确后转化M15， 经IPTG37℃诱导4 h后， SDSPAGE显示融合蛋白（表达产物）以包涵体形式存在。用镍柱对融合蛋白进行纯化， 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠， 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合， 经流式细胞术（FCM）分析和多次克隆化培养， 筛选出特异分泌鼠抗人cKit分子mAb的杂交瘤细胞株。采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定。结果: 成功表达及纯化了人cKit重组蛋白， 并获得1株持续、 稳定分泌鼠抗人cKit mAb的杂交瘤细胞株， 命名为SRJ1。ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的cKit分子， 并与人正常外周血细胞无交叉反应。值得注意的是， Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群， 虽然其表达cKit（Ab81 mAb的结合正常）。结论: 成功构建了原核表达载体pQE30Kit45， 并获得高纯度的人pQE30Kit45重组蛋白; 成功制备了1株特异性的鼠抗人cKit mAb杂交瘤。其所分泌的抗体能特异地识别人cKit分子， 并且可能成为区分细胞表面表达不同cKit分子的潜在检测工具。

【关键词】 cKit; 原核重组蛋白; 杂交瘤; 单克隆抗体; 白血病

　　［Abstract］ AIM: To prepare anticKit monoclonal antibodies and characterize their specificity of epitope recognition. METHODS: cDNA encoding human cKit extracellular domain was constructed into a procaryotic expression vector pQE30 and the correctness of the reconstructed plasmid pQE30KitD45 was verified by sequencing. The plasmid was transformed into E.coli M15 strain. Recombinant 6×His pQE30KitD45 was expressed after induction by IPTG for 4 h. Then SDSPAGE results suggested that the products mainly formed inclusion bodies. The fusion protein was further purified with NiNTAHis affinity chromatography and then used to immunize BALB/c mice. The hybridomas were achieved by fusing the immunized spleen cells with the Sp2/0 myeloma cell line. The positive clones were screened by FCM with CHOhKit cells. Hybidoma clones secreting anticKit antibodies were further subcloned and investigated for their biological activities by Western blot， rapid isotyping analysis and FCM. RESULTS: Recombinant human cKit fusion proteins were in vitro expressed and purified to be used as immunogen. One stable hybridoma cell line， which continuously secrets specific anticKit monoclonal antibody ((SRJ1)) was established. The biological activity studies showed that the monoclonal antibody recognized the natural cKit expressed on the Kasumi leukemia cell line， but failed to bind to the normal human peripheral blood cells. Interestingly， this monoclonal antibody failed to recognize a subpopulation of Kasumi cells that is reactive with the commercial anticKit mAb Ab81 suggesting that the cKit expressed by this subpopulation contains some sequencial and/or structural aberrations that are distinguishable by mAb SRJ1. CONCLUSION: With an immunization procedure using purified recombinant human cKit fusion proteins. a hybridoma cell line continuously and stably secreting anticKit monoclonal antibody has been established. The monoclonal antibody SRJ1 specifically recognizes human cKit expressed on the leukemia cells， and may provide a novel approach to analyze the possible structural variations of cKit expressed by different cells.

　　［Keywords］cKit; procaryotic fusion proteins; hybridoma; monoclonal antibody; leukemia

自cKit受体被发现以来， 其与干细胞因子（SCF）就作为一组重要的受体配基复合物通过激活下游信号通路， 产生强大的连锁反应， 从而在细胞的分化增殖等调控中发挥着举足轻重的作用。迄今为止， 二聚化结构及十几条激酶介导的信号通路被陆续证实与cKit的持续活化密切相关。而针对这一异常活化设计的靶向药物也陆续投入应用， 这都成为目前人类相关肿瘤［如急性髓性白血病（AML）、 胃肠道间质瘤（GIST）等］研究的热点［1-3］。但世界范围内cKit相关抗体类药物的应用尚处于萌芽状态， 激酶抑制剂类药物的广泛应用却已经发现了许多不良反应。故本实验中我们通过工程菌表达并且纯化了cKit的部分蛋白片段， 将其免疫小鼠获得了特异性的单克隆抗体（mAb）， 为进一步探讨该蛋白的生物学功能提供了有利的手段。

1 材料和方法

　　1.1 材料 IPTG、 dNTP、 Taq DNA聚合酶， ECL试剂购自上海生工公司， pGEMT载体及T4连接酶购自Promega公司， 限制性内切酶购自TaKaRa公司， 割胶回收试剂盒购自Axygen公司， DNA marker购自天根生物公司， F12、 RPMI1640、 次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷（HT）和氨基喋呤次黄嘌呤胸腺核苷（HAT）均购自Gibco公司， 胎牛血清购自JRH公司， 聚乙二醇、 弗氏完全及不完全佐剂购自Sigma公司， 抗cKit mAb(Ab81)购自Santa Cruz Biotechnology， antihis mAb为本所保存， 羊抗小鼠IgGHRP购自Calbiochem公司， NiNTA柱及纯化试剂盒购自Qiagen公司。原核表达载体pQE30、 感受态细菌E.coli DH5α和E.coli M15由本室保存; hpGEMTKit由本所克隆并保存。小鼠骨髓瘤细胞（Sp2/0）、 中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及稳定表达cKit的CHOhKit细胞株(用1 800 bp的cKit序列构建的真核表达载体转染的CHO细胞)为本室所建立并传代保存; 免疫用BALB/c小鼠来自本校医学院动物中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组质粒的构建 根据人cKit基因的胞外编码区序列和pQE30多克隆位点， 上游引物为: 5′CGGGATCCGTCACAACAACCTTGGAAGTAGT3′， 下游引物为: 5′CCCAAGCTTTACGATTACGAAACCAATCAG3′， 划线处为BamH I和Hind III酶切位点。以hpGEMTKit质粒为模板， PCR扩增获得hcKit胞外编码区产物。PCR反应条件为: 95℃预变性5 min， 95℃变性30 s， 57℃退火30 s， 72℃延伸30 s。纯化后的PCR产物经BamH I和Hind III双酶切后， 克隆入pQE30载体， 然后转化大肠杆菌DH5α， 挑取阳性克隆， 经酶切鉴定与预期结果相符， 送公司测序。

　　1.2.2 hcKit重组蛋白的诱导表达及纯化 将测序正确的pQE30hKitD45质粒转化到M15菌中， 在LB（Amp+Kana）平板培养过夜， 挑取阳性克隆37℃摇床培养过夜， 以1∶100的比例接种于100 mL LB培养基， 37℃摇菌培养至A600＝0.6～0.8时加入终浓度为1 mol/L IPTG， 于37℃诱导4 h。4℃、 5 000 g离心10 min， 弃上清， 冷PBS洗涤2次， 用原体积1/10的变性缓冲液（8 mol/L尿素， 0.5 mol/L TrisHCl）重悬细菌， 加PMSF至终浓度为1 mmol/L， 冰浴超声破菌。4℃、 12 000 g离心20 min， 各取上清和沉淀进行SDSPAGE， 目的蛋白主要以包涵体形式存在。用His纯化柱NiNTA对蛋白进行纯化， 先用1体积的缓冲液B（0.1 mol/L Nah3PO4， 0.01 mol/L TrisHCl， 8 mol/L尿素， pH8.0）洗柱2次， 将包涵体蛋白上清液缓慢加入NiNTA柱， 用缓冲液C（0.1 mol/L Nah3PO4， 0.01 mol/L TrisHCl， 8 mol/L尿素， pH6.3）洗柱2次， 再用缓冲液D（0.1 mol/L Nah3PO4， 0.01 mol/L TrisHCl， 8 mol/L尿素， pH5.9）洗柱4次， 最后用缓冲液E（0.1 mol/L Nah3PO4， 0.01 mol/L TrisHCl， 8 mol/L尿素， pH4.5）洗柱4次。将最终的蛋白液收集于EP管内， 常规SDSPAGE鉴定纯化的样品。BCA法测定纯化蛋白浓度。

　　1.2.3 动物免疫 以纯化的cKitD45蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠， 首次免疫为150 μg重组cKitD45蛋白与等量完全弗氏佐剂混匀， 背部多点皮下注射。3周后， 再用50 μg抗原重复免疫1次。间隔2周后用50 μg抗原再次重复免疫， 免疫后断尾采血， 分离血清用间接ELISA法检测抗血清抗体效价。2周后用同样抗原量尾静脉注射加强免疫， 3 d后细胞融合。

　　1.2.4 细胞融合及mAb的产生 免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合， 用含20 g/L HAT、 100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液选择性培养。用纯化的蛋白包被， 间接ELISA法进行阳性孔筛选。设1∶1 000阳性血清对照和牛奶空白对照。然后待阳性细胞克隆布满1/3或1/4培养孔时， 吸取上清， 以CHOhKit转基因细胞为抗体筛选的阳性细胞， 以CHO细胞为阴性对照细胞， 采用间接免疫荧光标记法， 经FCM筛选。选择抗体效价高、 呈单个克隆生长、 形态良好的细胞进行有限稀释克隆化。阳性孔经多轮克隆化培养及扩大传代， 以BALB/c小鼠大量制备mAb腹水。

　　1.2.5 抗体的鉴定 抗体的特异性通过Western blot的方法进行鉴定。

2 结果

　　2.1 pQE30hKitD45重组表达质粒的构建及鉴定 以hpGEMTKit质粒为模板， PCR扩增获得hcKit胞外编码区产物cKitD45， 全长为686 bp， 与预期结果相符（图1）。直接将纯化的PCR产物与T载体连接， 菌落经蓝白斑初步鉴定后， 提取阳性克隆的质粒DNA， 分别用BamH I和Hind III酶切pQE30及pGEMTKitD45质粒， 将片段与双酶切后的pQE30载体相连。并再次酶切鉴定重组质粒pQE30hKitD45， 目的片段大小与预期相符（图2）。测序结果显示目的序列与NCBI（Accession Number : NM_000222）相应的序列相符， 证实表达载体构建成功。

　　2.2 pQE30hKitD45融合蛋白的诱导表达及Western blot鉴定 pQE30hKitD45阳性菌株经IPTG诱导后SDSPAGE显示: 在37℃、 1M IPTG诱导4 h的条件下， 融合蛋白的表达达到高峰， 蛋白条带位于696 bp处（与预期相符）。该重组蛋白主要以包涵体形式存在， 用NiNTA柱进行纯化后， 蛋白纯度扫描证实蛋白纯度在90%以上， Bradford法测定纯化后的hcKitD45蛋白浓度为300 mg/L（图3）。

　　2.3 mAb的制备与鉴定

　　2.3.1 抗人cKit mAb杂交瘤细胞株的建立 用纯化的hcKitD45融合蛋白免疫BALB/c小鼠， 获得的小鼠抗血清经ELISA检测， 效价高达1×106。按照常规方法进行细胞融合， 杂交瘤培养上清经蛋白ELISA板筛选后， 将流式复测阳性率真达到95%以上的克隆进行3次亚克隆化培养， 获得1株稳定分泌特异性鼠抗人cKit mAb的杂交瘤细胞株， 命名为SRJ1。该株杂交瘤细胞经体外连续传代（40代以上）培养， 液氮冻存1年后复苏， 仍生长良好， 稳定分泌抗体。

　　2.3.2 mAb类、 亚型的鉴定及纯化 用ISO2小鼠mAb亚型检测试剂盒检测所取腹水， 结果为IgG2a型mAb， 轻链为κ链。3 mL腹水按照IgG2a抗体纯化方法: Protein A亲和层析进行纯化。经离心、 稀释、 过柱及透析后获得纯化抗体。每毫升腹水约获1.5 mg抗体。

　　2.3.3 mAb特异性的分析 （1）用此mAb为一抗（1∶10 000）， HRP标记的抗鼠IgG为二抗， 结果表明， CHOhKit裂解后在Mr 110 000左右出现预期蛋白条带（而完整的cKit的条带大小约为145 000)（图4）， CHO细胞则无对应条带出现。由此说明制备的mAb能特异地与cKit蛋白相互作用。（2）抗体与正常人外周血细胞反应， 应用流式细胞术测定， 与红细胞和各系白细胞的反应均为阴性， 也与对照结果相符（图5）。

　　2.3.4 mAb对不同细胞表面cKit分子的识别 FCM分析细胞膜荧光标记百分率结果表明， mAb SRJ1能特异识别cKit分子（图4）。在检测抗体细胞表达谱时发现， mAb SRJ1能识别白血病细胞株Kasumi。在此白血病细胞株表面检测到了高水平的cKit分子。同时， 在抗体饱和量时， Ab81的荧光强度不发生明显变化， 而SRJ1则显现一个类阴性峰， 表明SRJ1可能在表达不同cKit分子的Kasumi细胞表面可以区分不同的细胞亚群(图6)。

3 讨论

　　cKit在配子形成、 造血、 肥大细胞发育及功能、 黑色素生成等方面均发挥着重要的作用。因此， c图6 饱和浓度mAb SRJ1对CHOhKit细胞及白血病细胞株Kasumi的FCM检测Kit表达产物的完全缺失所致的功能丧失及碱基序列突变导致的功能性激活（包括点突变， 缺失突变， 错义突变， 插入突变等）与人类某些肿瘤（如AML、 GIST、 黑色素瘤等）的发生密切相关。近几年发现一系列致病相关性突变， 例: JMD区中FC522突变可引起受体自发磷酸化而激活， 从而导致非配基依赖性地信号传导的发生。而此类病例对于酪氨酸激酶抑制剂Imatinib的应用极为敏感［4］; NK822突变主要与AML/ETO所介导的白血病相关， 应用Imatinib可以有效抑制下游信号传递， 从而抑制恶性细胞的分裂增殖［5］; DV816突变主要发生于系统性全身肥大细胞增多症及肥大细胞性白血病， 其主要增强了表达ckit受体细胞的迁徙能力， 并且在SCF含量丰富的组织中促进了肥大细胞的过度增生［6］。但也发现这种类型的突变能够造成Imatinib耐药病例的产生。针对Imatinib应用的局限性， 研究开发各种新型的激酶抑制剂亦成为另一热点。目前， PKC421、 AP23464、 Dasatinib等正尝试被应用于Imatinib耐药病例的治疗。但是， 激酶类药物的应用本身就存在某些严重的副作用， 例如: 药物对于野生型cKit活性的抑制， 从而干扰正常细胞的分化增殖; 药物对其它结构或功能类似的激酶作用不同程度的抑制， 从而阻断重要的体内正常信号转导通路， 影响细胞正常功能; 另还有研究表明， 药物的应用大大增加了诱发受体二次突变的机率。因此， 如何从根本上寻找到一种合理有效的抑制剂类药物对于cKit相关疾病的诊治将具有十分重要的意义。而最新的研究结果表明， cKit胞外免疫球蛋白第四、 五区的某些氨基酸残基， 例如: 精氨酸381， 谷氨酸386等， 对于二聚化过程中受体单体间的偶联起着关键性的作用［7］。这无疑为未来针对cKit受体相关肿瘤的治疗药物及方法的开发提供极为有效的新基点。

　　Kasumi是经典的t(8; 21)/M2细胞系。研究表明， Kasumi细胞表面所表达的cKit存在Asn822Lys位的突变， 且突变的cKit的数量约为正常cKit表达量的5倍。Asn822在RTK家族的激活环中高度保守， 能引起非配体依赖的cKit受体的激活， 使Kasumi细胞系成为体外研究具有cKit突变的AML的理想模型。

　　本研究中我们成功表达了重组人cKit， 制备了高特异性、 高效价的抗人cKit mAb， 同时表达的重组蛋白具有较高的纯度和较强的免疫原性; 同时， FCM针对白血病细胞株Kasumi的结果也提示其可能可以作为区分正常或突变cKit分子， 或为区分不同的cKit分子构象提供潜在的检测方法。综上所述， 这些为深入研究cKit激活的相关蛋白质的相互作用及了解cKit生物学功能及探讨免疫相关治疗调控机制提供了有利的手段; 并且也为进一步研究cKit的生理功能及提高对体内生理和病理造血机制的认识， 并最终为临床治疗cKit相关的多种恶性血液肿瘤提供新的思路。

参考文献

［1］ Roskoski R， Jr. Structure and regulation of Kit proteintyrosine kinasethe stem cell factor receptor［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2005， 338(3): 1307-1315.

［2］ Zhang Z， Zhang R， Joachimiak A， et al. Crystal structure of human stem cell factor: implication for stem cell factor receptor dimerization and activation［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97(14): 7732-7737.

［3］ Wang YY， Zhou GB， Yin T， et al. AML1ETO and CKIT mutation/overexpression in t(8; 21) leukemia: implication in stepwise leukemogenesis and response to Gleevec［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2005， 102(4): 1104-1109.

［4］ Akin C， Fumo G， Yavuz AS， et al. A novel form of mastocytosis associated with a transmembrane ckit mutation and response to imatinib［J］. Blood， 2004， 103(8): 3222-3225.

［5］ Beghini A， Bellini M， Magnani I， et al. STI 571 inhibition effect on KITAsn822Lysmediated signal transduction cascade［J］. Exp Hematol， 2005， 33(6): 682-688.

［6］ Gotlib J， Berube C， Growney JD， et al. Activity of the tyrosine kinase inhibitor PKC412 in a patient with mast cell leukemia with the D816V KIT mutation［J］. Blood， 2005， 106(8): 2865-2870.