AFP启动子调控的小鼠IL1β重组载体的构建及其在肝癌H22细胞中的表达

　　　　 作者：李青春， 梁淑娟， 王雪净， 刘艳艳， 王焕芹， 张素华

【摘要】 目的: 构建小鼠甲胎蛋白（AFP）启动子调控的小鼠IL1β（mIL1β）重组真核表达载体pafpIRES2EGFPmIL1β， 并检测其在真核细胞内的表达。方法: 重叠延伸PCR技术（SOEPCR）获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒（CMV）增强子区（ECMV）的嵌合基因， 将其克隆至pIRES2EGFP载体， 构建肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2EGFP。RTPCR扩增小鼠IL1β基因， 克隆至pafpIRES2EGFP， 进行酶谱分析及DNA序列测定。利用jetPEI法将其分别转染h32细胞和YAC1细胞， 倒置相差荧光显微镜下观察， RTPCR分析mIL1β表达水平的变化。结果: SOEPCR方法获得长度为537 bp的AFP和ECMV嵌合基因， 克隆后经限制性酶切和DNA序列分析确认成功构建了小鼠肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2EGFP。PCR扩增小鼠IL1β基因后将其克隆至pafpIRES2EGFP， 获得AFP启动子调控的小鼠IL1β重组真核表达载体pafpIRES2EGFPmIL1β， 细胞转染分析证实， 该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性高效表达， RTPCR检测可见转染细胞中mIL1β水平明显升高。结论: 成功构建真核表达载体pafpIRES2EGFPmIL1β， 该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达IL1β。

【关键词】 IL1β; AFP启动子; 组织特异性; 肝癌

　　［Abstract］ AIM: To establish a hepatoma specific murine IL1β (mIL1β) expression vector operated by AFP promoter and analysis its expression in h32 cell. METHODS: The chimeric operating sequence composed of the minimal AFP promoter and CMV enhancer(ECMV) was prepared through SOEPCR. The sequence was inserted to replace the conventional enhancer and promoter in pIRES2EGFP to establish the novel hepatoma specific vector pafpIRES2EGFP. Full length of murine IL1β was amplified through RTPCR by pfu DNA polymerase followed by cloning to establish the recombinant pIRES2EGFPmIL1β expression vector verified through PCR， restriction enzyme assay， DNA sequencing and cell transfection. pafpIRES2EGFPmIL1β was tranfected into h32 hepatoma cells and YAC1 lymphoma cells in a transient transfection system mediated by jetPEI. Expression of the vector was observed under fluorescent microscope 48 h after transfection. Expression level of mIL1β was detected by RTPCR. RESULTS:　　A 537 bp chimeric AFP promoter and ECMV was yield and inserted to establish a novel hepatoma specific vector pafpIRES2EGFP proved by restriction enzyme assay， DNA sequencing and transfection. Full length murine IL1β was then amplified and cloned to establish the recombinant expression vector pafpIRES2EGFPmIL1β verified through repeated clony PCR， restriction enzyme assay by EcoR I and Xho I， DNA sequencing and transfection. Purified pafpIRES2EGFPmIL1β was transiently transfected into h32 cells and YAC1 cells by jetPEI， and bright green fluorescence was only seen on the surface of h32 cells， indicating that pafpIRES2EGFPmIL1β can specifically express target gene within the murine hepatoma cells. Simutaneously， the expression level of mIL1β was markedly elevated in h32/mIL1β in RTPCR assay. CONCLUSION: We successfully prepared a hepatoma specific expression vector named pafpIRES2EGFPmIL1β that could expression high level of murine IL1β in a transient transfection system.

　　［Keywords］IL1β; AFP promoter; tissuespecific; hepatoma

IL1β是炎症状态下产生的一种重要的高反应促炎性因子， 是体内调节免疫和炎症反应的关键介质。不仅在某些炎症性疾病中IL1β表达水平升高［1］， 诸多肿瘤也已证实分泌高水平的IL1β， 它与肿瘤发生发展的关系及其在肿瘤治疗中的靶向作用逐渐引起人们的关注。我们前期的工作发现， 肝癌患者的血清表达促炎性因子IL1β的水平显著增高［2］， 如何维持IL1β在肝癌细胞中的特异性表达是深入研究和证实其生物学功能的重要影响因素。甲胎蛋白(αfetoprotein， AFP)在肝癌细胞中能高效特异表达， 本研究中我们利用AFP的最小启动子作为调控序列， 以期达到控制IL1β在肝癌细胞中特异表达的目的， 为后续的研究IL1β在肝癌细胞中作用和干预治疗肝癌提供研究工具。

1 材料和方法

　　1.1 材料 h32细胞和YAC1细胞株、 pIRES2EGFP载体、 DH5α本室保存， 新生牛血清购自杭州四季青公司， Pfu和Taq DNA聚合酶、 Nde I、 Nhe I、 EcoR I及Xho I限制性内切酶、 T4连接酶购自MBI公司， UNIQ10柱式细胞基因组DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程公司， H.Q.&&.Q.质粒微量抽提试剂盒、 血液RNA提取试剂盒购自安徽优晶公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重叠延伸PCR技术扩增AFP最小启动子和CMV增强子嵌合调控序列 按GenBank（AB053573）中登录的小鼠AFP启动子基因序列和质粒pIRES2EGFP物理图谱中CMV增强子（ECMV）序列设计引物， 由上海生工生物工程公司合成。ECMV上游引物P1: 5′AAT AGG GAC TTT CCA TTG ACG3′， 下游引物P2: 5′AAT GTT CTT CAC CAT CAA AAC AAA CTC CCA TTG ACG3′， 目的片段中含有Nde I限制性酶切位点。AFP启动子上游引物P3: 5′ATG GTG AAG AAC ATT TGC AGC3′， 下游引物P4: 5′TTGCTAGCTTC GAG CAG TGC TGC TGA AGT CCT T3′， 引入Nhe I限制性酶切位点可用于定向克隆。在ECMV基因下游引物的5′端含有与AFP启动子上游引物互补的15 bp序列。PCR反应条件: 94℃ 5 min后， 94℃ 30 s， 53℃ 30 s， 72℃ 30 s， 30个循环， 最后72℃延伸10 min。上述PCR产物纯化后， 在pfu DNA聚合酶的作用下通过重叠延伸PCR（splicing by overlapping extension PCR， SOEPCR）进行拼接， 反应条件: 94℃ 5 min后， 94℃ 30 s， 42℃ 30 s， 72℃ 30 s， 共20个循环， 72℃延伸10 min。所得产物利用P1和P4进行后续PCR扩增， 条件是:　　 94℃ 5 min后， 94℃ 1 min， 53℃ 1 min， 72℃ 1 min， 共30个循环， 72℃延伸10 min。

　　1.2.2 肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2EGFP的构建 上述产物纯化后与pIRES2EGFP分别用Nde I和Nhe I双酶切进行定向连接， 产物转化DH5α感受态细胞， 培养后挑取单菌落， 提取质粒进行PCR及双酶切鉴定， 最后进行DNA序列分析， 获得小鼠肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2EGFP。

　　1.2.3 AFP启动子调控的小鼠IL1β表达载体的构建 以本课题组已构建成功的pIRES2EGFPmIL1β为模板， PCR扩增小鼠IL1β（mILβ）全长基因， 与pafpIRES2EGFP载体同时进行EcoR I和Xho I双酶切后连接， 产物转化DH5α感受态细胞， 通过菌落PCR、 EcoR I+Xho I 限制性酶谱分析鉴定， 小鼠IL1β重组表达载体pafpIRES2EGFPmIL1β。

　　1.2.4 重组载体转染h32细胞 将pafpIRES2EGFP和pafpIRES2EGFPmIL1β重组表达载体利用jetPEI介导的方法分别转染h32细胞（h32/mock和h32/mIL1β）和YAC1（YAC1/mock和YAC1/mIL1β）细胞， 48 h后倒置相差荧光显微镜下表达情况。

　　1.2.5 RTPCR分析mIL1β表达水平的变化 取h32/mIL1β细胞、 h32/mock细胞， 血液RNA提取试剂盒方法抽提细胞总RNA方法， 分别用mIL1β上、 下游引物， 扩增小鼠IL1β基因全长。

　　2 结果

　　2.1 pafpIRES2EGFP的构建及鉴定 从h32肝癌细胞中提取DNA， 分别以该DNA和pIRES2EGFP质粒为模板， 进行PCR扩增， 得到两段目的基因， 长度分别为229 bp和324 bp左右， 与预期片段长度相符。利用SOE方法进行拼接， 扩增后得到一条长约537 bp的条带， 与预期的AFP+ECMV嵌合基因长度一致（图1）。产物回收后与pIRES2EGFP真核表达载体进行Nde I和Nhe I限制性双酶切， 产物连接转化DH5α感受态细胞， 挑取单菌落， 小量提取质粒， 利用Nde I和Nhe I进行限制性酶切， 可见切出一大小约459 bp的目的基因片段， 将重组质粒送大连宝生物公司进行DNA序列分析正确后， 确认获得小鼠真核表达载体pafpIRES2EGFP。

　　2.2 pafpIRES2EGFPmIL1β的构建及鉴定 以本课题组已构建成功的pIRES2EGFPmIL1β为模板， PCR扩增mIL1β全长基因， 与pafpIRES2EGFP载体同时进行EcoR I和Xho I双酶切， 酶切产物回收纯化后连接过夜， 转化DH5α感受态细胞， 通过菌落PCR（图2）、 质粒EcoR I+Xho I限制性酶谱分析鉴定（图3）， 获得AFP启动子调控的小鼠IL1β重组表达载体pafpIRES2EGFPmIL1β。

　　2.3 重组载体转染h32细胞 通过阳离子聚合物jetPEI将重组载体pafpIRES2EGFPmIL1β以及空载体pafpIRES2EGFP转入h32细胞及YAC1细胞， 分别称为h32/mIL1β， h32/mock和YAC1/mIL1β， YAC1/mock。48 h后倒置相差荧光显微镜下观察， 可见h32/mIL1β和h32/mock细胞， 发出明亮的绿色荧光（图4）， 证明载体已被成功地转染至h32细胞中， 而YAC1/mIL1β和YAC1/mock细胞均无荧光表达， 证明载体构建成功能够在肝癌细胞中特异性表达。

　　2.4 RTPCR分析mIL1β表达水平 提取细胞总RNA， 利用小鼠IL1β的特异性引物进行RTPCR检测转染细胞中mIL1β的表达， 结果表明， 在瞬时转染pafpIRES2EGFPmIL1β质粒的h32细胞中， IL1β全长基因的表达水平明显升高， 与转染pafpIRES2EGFP空载体的细胞相比具有显著差异， 证明构建的重要载体能够在h32细胞中高效表达目的基因（图5）。

　　 3 讨论

　　IL1家族由3个高度同源的成员组成: IL1α、 IL1β和IL1受体拮抗剂， 其编码基因定位于人染色体2q12q21， 分布于430 kb的区域并紧密连锁。IL1β是一个非常重要的促炎性细胞因子， 是体内调节免疫和炎症反应的核心介质［3］。Kurtzman等［4］研究表明， IL1β在乳腺癌中呈高表达， 并在肿瘤生长及转移中发挥极其重要的作用。幽门螺杆菌与胃炎及胃癌发生关系密切， 该菌感染能够促使IL1β的产生， 而IL1β具有强抑制胃酸分泌的作用， 对胃癌发生、 生长有促进作用［5］。Maccio等［6］研究了晚期上皮性卵巢癌患者血清中IL1β的水平， 发现与正常对照相比， IL1β显著增高。肝癌是一种上皮来源的恶性肿瘤， 研究表明， IL1β与肝脏病变的发展密切相关［7］。研究发现， 慢性肝炎、 肝炎性肝硬化、 肝癌患者血清中IL1β表达均明显高于对照组［2， 7］， 这提示: 慢性肝炎与肝炎性肝硬化、 肝癌患者体内存在IL1β的分泌异常， 并且该因子的出现可能与肿瘤的恶性行为有关， 因而可能成为潜在分子标靶。

　　为了实现IL1β基因在肝癌中的特异性表达， 深入研究该因子在肝癌细胞生长等生物学行为中的作用， 本研究选择AFP最小启动子与ECMV构成新型调控序列， 目的是利用增强子ECMV提高基因表达效率的作用， 以及AFP在肝癌组织的特异性表达， 达到调控基因靶向、 持续、 高效、 稳定表达的目的， 同时避免对其他组织细胞的影响。研究表明， 我们构建的由AFP启动子调控的载体pafpIRES2EGFPmIL1β， 能够在AFP阳性的h32肝癌细胞中特异性表达， 使IL1β的水平明显升高， 该载体的成功构建为进一步探讨IL1β在肝癌发生发展过程中的作用提供了重要工具。

参考文献

［1］ 朱参胜， 冯清华， 于曰祥， 等. 大骨节病患者血清促炎症细胞因子水平的检测［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(1): 84-85.

［2］ Tian Z， Shen X， Feng H， et al. IL1βbeta attenuates IFNalpha betainduced antiviral activity and STAT1 activation in the liver: involvement of proteasomedependent pathway［J］. J Immunol， 2000， 165(7): 3959-3965.

［3］ Boraschi D， Bossù P， Macchia G， et al. Structurefunction relationship in the IL1 family［J］. Front Biosci， 1996， 1: 270-308.

［4］ Kurtzman SH， Anderson KH， Wang Y， et al. Cytokines in human breast cancer: IL1alpha and IL1beta expression［J］. Oncol Rep， 1999， 6(1): 65-70.

［5］ ElOmar EM， Carrington M， Chow WH， et al. Interleukin1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer［J］. Nature， 2000， 404(6776): 398-402.

［6］ Maccio A， Lai P， Santona MC， et al. High serum levels of soluble IL2 receptor， cytokines， and C reactive protein correlate with impairment of T cell response in patients with advanced epithelial ovarian cancer［J］. Gynecol Oncol， 1998， 69(3): 248-252.