强抗原决定簇hAFP542-550在真核细胞膜定位表达研究

　　　　 作者：羊东晔 李彩虹， 蓝方， 张扬清， 卢放根， 杨峥嵘， 黄来强

【摘要】 目的: 构建包含甲胎蛋白强抗原决定簇hAFP542-550、 EGFP 和GPI锚定蛋白GPC3三者组成的融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP表达质粒pGPC3EGFP， 确定其定位表达在真核细胞膜上， 以强化靶细胞的免疫原性。方法: ①采用RTPCR方法从人胎盘组织总RNA中调取GPC3基因， 化学合成基因片段KOZAKGPCN＋afp542-550， 并从pEGFPN1质粒中扩增EGFP基因， 三者嵌合构建融合蛋白的表达质粒pcDNA3.1(+)/GPCN＋afp542-550EGFPGPCC（pGPC3EGFP）; ②以Lipofectamine 2000转染质粒pGPC3EGFP 入肝癌细胞株HepG2（GPC3+AFP+）， 转染后24 h和48 h引物GPCNF和EGFPr RTPCR及Western blot检测融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP表达; ③对照质粒pEGFPN1和pGPC3EGFP转染HepG2， 荧光显微镜观察比较两种质粒EGFP蛋白表达的部位; pGPC3EGFP转染人胚肾HEK293细胞（GPC3-AFP-）， 提取细胞膜蛋白和可溶蛋白Western blot检测融合蛋白表达。结果: ①成功构建pGPC3EGFP质粒; ②融合蛋白可在 HepG2中表达; ③与pEGFPN1不同， 融合蛋白主要在胞膜上出现荧光反应， 胞质内仅见散在零星荧光; 转染后HEK293细胞的膜蛋白中检测到融合蛋白表达， 而可溶蛋白中未检出。结论: pGPC3EGFP可以在真核细胞中表达， 表达的融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP仍然定位表达在细胞膜， 是一种新型GPI再锚定蛋白。

【关键词】 人AFP542-550， glypican3; 增强绿色荧光蛋白EGFP; 真核细胞; 蛋白质工程

　　［Abstract］ AIM: To construct the recombinant plasmid of pGPC3EGFP containing human AFP542-550 gene， EGFP gene and GPC3 gene to express fusion protein GPC3hAFP542-550EGFP and to discover its localization on cytoplasmic membrane. METHODS: GPC3 gene was obtained from total RNA of human placental tissues by RTPCR; After the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene was amplified from pEGFPN1 plasmid and the gene segment ofKOZAKGPCN＋afp542-550was chemically synthesized， the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/GPCN＋afp542-550EGFPGPCC (pGPC3EGFP) containing three chimeric genes of strong epitope hAFP542-550， GPIanchored protein GPC3 and EGFP was constructed. The fusion protein (GPC3hAFP542-550EGFP) was detected on RNA and protein levels at 24 h and 48 h after pGPC3EGFP was transfected into HepG2 (GPC3+AFP+) via lipofectamine 2000. EGFP expression was observed by fluorescent microscopy after pGPC3EGFP was transfected into HepG2 using pEGFPN1 plasmid transfection as a positive control. The fusion protein in both membrane proteins and soluble proteins extracted from the transfected 293 cells (GPC3-AFP-) was detected by Western blot using GPC3 monoclonal antibody as primary antibody. RESULTS: The recombinant plasmid pGPC3EGFP was successfully constructed through restriction endonuclease digestion and sequencing; pGPC3EGFP expression in HepG2 cells was detected not only by RTPCR using specific primers (GPCNF and EGFPr) but also by Western blot using GFP polyclonal antibody and GPC3 monoclonal antibody. Green fluoresce was mainly found around pGPC3EGFP transfected HepG2 cell periphery beside sporadic distribution in cytoplasm， but that of pEGFPN1 transfected HepG2 cell was evenly distributed in the whole cell. Moreover， the fusion protein was not detected in soluble proteins but membrane proteins extracted from transfected 293 cells. CONCLUSION: The recombinant plasmid of pGPC3EGFP based on protein engineering theory can express fusion protein (GPC3hAFP542-550EGFP) in eukaryotic cells. Furthermore， the fusion protein is still located on cytoplasmic membrane， which is a characteristic of GPIanchored membrane protein， and is a new GPIreanchored protein.

　　［Keywords］human AFP542-550; glypican 3; enhanced green fluorescent protein;　　 eukaryotic cell; protein engineering
α甲胎蛋白（αfetoprotein， AFP）是人体一种肿瘤性抗原， 研究表明超过80%的肝癌细胞可以合成分泌AFP， 是临床上诊断原发性肝癌的一个重要指标。但是机体免疫系统在个体发育时AFP特异性T细胞被清除［1］， 且可能受空间构象影响其分子中的抗原决定簇难以暴露， 无法激活免疫系统实现对癌细胞的杀伤作用， 因而AFP作为“自身”肿瘤性抗原机体对其表现为免疫耐受。本研究拟将AFP抗原性短肽经肝癌细胞翻译后分泌出胞， 并定位表达在胞膜表面， 使单个肝癌细胞本身成为一种强免疫原性颗粒， 增加免疫系统对其识别能力， 诱导T细胞活化以实现对其免疫杀伤。结合计算机分析和转基因小鼠实验确定在AFP蛋白质分子中hAFP542-550、 hAFP137-145、 hAFP158-166、 hAFP325-331氨基酸序列是其抗原决定簇， 其中以hAFP542-550具备良好的免疫原性［1， 2］。 应用“蛋白质工程”技术理论将在肝癌细胞高表达的膜锚定蛋白glypican 3 （GPC3）基因改造， 与hAFP542-550基因afp542-550嵌合， 为了便于检测， 加入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因， 三者共同组建pGPC3EGFP质粒， 检测该质粒是否能在真核细胞中表达融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP， 且能定位在胞膜上。

1 材料和方法

　　1.1 材料 胎盘组织取自北大深圳医院妇产科; 细胞株HepG2、 HEK293细胞购自武汉中国典型培养物保藏中心， 由深圳市基因与抗体治疗重点实验室保存; pcDNA3.1(+)质粒购自Invitrogen公司、 pEGFPN1质粒购自Clontech公司和大肠杆菌菌种JM109、 DH5α由深圳市基因与抗体治疗重点实验室保存。反转录系统试剂盒、 pGEMT试剂盒（Promega公司）; pyrobest 酶、 LA Taq酶和限制性内切酶EcoR I、 Xba I、 Ligation mix试剂盒（TaKaRa公司）; QIAGEN plasmid mini Kit（Qiagen公司）， 质粒小提试剂盒和胶纯化回收试剂盒（Omega公司）; 限制性内切酶Kpn I、 Nhe I、 EcoR I、 耐热磷酸酶、 T4连接酶（New England公司）; TRIzol、 Lipofectamine 2000转染试剂盒， DMEM（高糖）培养基、 2.5 g/L胰蛋白酶+EDTA、 链霉素和青霉素双抗、 兔抗GFP多抗、 Xgal和IPTG购自（Invitrogen公司）; 小鼠抗人GPC3 mAb（R&&D systems公司）; 山羊抗兔（小鼠）IgG重链和轻链辣根过氧化物酶底物（CalbiochemNovabiochem 公司）; LumiGLO Chemiluminescent Substrate显色液（KPL公司）; 预染蛋白质Marker SM0671 （深圳晶美公司）; 雀巢牌脱脂奶粉; PVDF 膜（BioRad公司）; cocktail complete mini 购自Roche公司， ProteoExtract Native Membrane Protein Extraction Kit 购自Merck公司。RIPA蛋白裂解液［150 mmol/L NaCl、 50 mmol/L TrisHCl (pH7.4)、 100 g/LTriton X100、 10 g/L脱氧胆酸、 1 g/L SDS和1 mmol/L EDTA］。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pcDNA3.1(+)/KOZAKGPCN＋afp542-550EGFPGPCC（pGPC3EGFP）质粒构建 所有引物和化学合成序列均由上海基康生物技术服务有限公司合成， 构建所需引物序列和相关质粒见表1， 表中带下划线的字母为酶切位点。表1 pGPC3EGFP质粒构建中引物和相关质粒

　　TRIzol抽提胎盘组织总RNA， 逆转录为cDNA备用。以GenBank号: NM_004484序列为模板设计引物TF和TR， 从cDNA中用 pyrobest酶扩增包含GPC3 ORF的基因片段LGPC3（1.851 kb）， 与 pGEMT载体连接， 转化JM109， 蓝白筛选后T7和Sp6引物对测序; 根据UniProtKB/SwissProt 号: P51654中GPC3蛋白质的信息: 将GPC3的整个cDNA 分成两段: N端分泌信号端 84 bp（128 aa）， C端锚定信号端1 659 bp（29580 aa）， 以pGEMT/LGPC3为模板， 引物GPCCf和GPCCr扩增GPCC片段(1 659 bp)， PCR产物送测序。EcoR I 和Xba I双酶切pcDNA3.1(+)质粒和GPCC的PCR纯化产物回收， 连接构建pcDNA3.1(+)/GPCC质粒。

　　化学合成KOZAKGPCN＋afp542-550片段， 两侧分别钩挂有相应酶切位点（5′端为Nhe I， 3′端为EcoR I）， 连入pMD18T载体。以该质粒为模板， GPCNF和GPCNR引物PCR扩增KOZAKGPCN＋afp542-550Kpn I (116 bp)， 加A后连入pGEMT构建pGEMT/GPCN＋afp542-550质粒， 送测序。

　　以pEGFPN1质粒为模板， 引物EGFPf和EGFPr扩增EGFP（不含起始和终止密码子）的片段（726 bp）， 加A后连入pGEMT构建pGEMT/EGFP质粒， 送测序。EcoR I和Kpn I双酶切pcDNA3.1(+)/GPCC质粒和pGEMT/EGFP质粒， 酶切产物纯化回收相连， 构建pcDNA3.1(+)/EGFPGPCC质粒; Nhe I和Kpn I双酶切pGEMT/GPCN＋afp542-550质粒和pcDNA3.1(+)/EGFPGPCC质粒， 切下的片断KOZAKGPCN＋afp542-550Kpn I连入载体中构建pcDNA3.1(+)/KOZAKGPCN＋afp542-550EGFPGPCC（pGPC3EGFP）质粒。

　　1.2.2 pGPC3EGFP质粒在真核细胞中的表达 以DMEM+100 mL/L胎牛血清（FBS）培养细胞HepG2（GPC3+AFP+）， 消化传代接种到6孔板和25 cm2培养瓶， 培养至汇合度70%～80% Lipofectamine 2000转染质粒; 分别在转染后24 h和48 h对转染细胞进行检测。以空白细胞组和单加质粒细胞组为对照， 转染后24 h和48 h收获细胞加入TRIzol。按照TRIzol说明书提取细胞总RNA， 逆转录为cDNA， 选取上游引物 GPCNF和下游引物EGFPr PCR扩增融合蛋白中的一段基因KOZAKGPCN＋afp542-550EGFP。以空白细胞组和单加质粒细胞组为对照（转染后48 h收获细胞）， 转染后24 h 和48 h收获lipo质粒实验组细胞， RIPA＋cocktail细胞裂解液提取总蛋白， 常规经75 g/L的SDSPAGE分离后， 转移至PVDF膜上， 分别以兔抗GFP 多抗和小鼠抗GPC3mAb为一抗， HRP标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG为二抗（工作稀释度1∶5 000）， KPL显色， 曝光照片。

　　1.2.3 pGPC3EGFP质粒表达后的亚细胞定位检测 pEGFPN1质粒作为阳性对照， 培养HepG2细胞接种到6孔板至汇合度80%～90%后lipofectamine 2000转染质粒pEGFPN1和pGPC3EGFP。每孔以lipo 5 μL转染4.0 μg DNA; 分别在转染后24 h和48 h在NIKON TE2000U荧光显微镜下观察两种质粒转染后的EGFP的表达。

　　人胚肾293细胞（HEK293）是没有内源性GPC3和AFP表达的一种真核细胞。依照ProteoExtract Native Membrane Protein Extraction Kit 说明书抽提空白HEK 293细胞和转染后24 h和48 h的lipo质粒组细胞的膜蛋白和可溶性蛋白， 常规经75 g/L的SDSPAGE分离后， 转移至PVDF膜上， 以小鼠抗人GPC3 mAb为一抗， HRP 标记的山羊抗小鼠IgG为二抗， KPL显色， 曝光照片。

2 结果

　　2.1 pGPC3EGFP质粒鉴定 根据质粒构建程序， 每步得到的质粒均酶切和测序鉴定正确后构建pGPC3EGFP质粒; 该质粒经过DNASTAR软件酶切图谱分析选择Sma I单酶切和Kpn I＋EcoR I双酶切鉴定， 结果与酶切图谱分析相符（图1）; 选取相应引物对该质粒进行测序结果与标准序列Blast比对正确， 没有点突变和移码。

　　2.2 pGPC3EGFP质粒在真核细胞HepG2中表达 (1)pGPC3EGFP质粒RNA水平表达检测: 从lipo质粒转染后24 h和48 h的HepG2中提取总RNA后， 特异引物GPCNF和EGFPr RTPCR扩增得到表达的基因片断大小与KOZAKGPCN＋afp542-550EGFP（854 bp）大小一致（图2）。(2) pGPC3EGFP质粒蛋白质水平表达检测: 采用DNASTAR软件对pGPC3EGFP质粒的基因进行翻译分析， 其表达的融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP包含831个氨基酸， Mr为93 700。以RIPA＋cocktail 细胞裂解液分别提取的空白细胞组（对照1）、 单加质粒组（对照2）以及lipo质粒转染后24 h和48 h实验组细胞总蛋白（孔板和25 cm2培养瓶）， GFP多抗为一抗Western blot检测结果显示: 两个对照组未检测出融合蛋白表达， 而在实验组中发现在Mr约94 000处见显影带（图3）。收获lipo质粒转染后24 h和48 h实验组细胞培养上清， 同时RIPA＋cocktail 细胞裂解液提取空白细胞组（对照1）、 单加质粒组（对照2）以及lipo质粒转染后24 h和48 h实验组总蛋白， 小鼠抗人GPC3 mAb为一抗Western blot检测结果显示: 细胞上清内也没有检测到融合蛋白表达， 两个对照组也未检测到表达， 而在实验组中24 h和48 h细胞裂解液中均在约Mr 94 000处可见显影带（图4）， βactin蛋白(Mr 44 000)表达为内对照。

　　2.3 融合蛋白GPC3hAFP542550EGFP定位表达于真核细胞膜 以pEGFPN1为阳性对照， 在荧光显微镜下观察， pGPC3EGFP质粒转染后24 h和48 h HepG2细胞周边膜部分出现了荧光反应， 并呈“帽”现象， 而胞质内仅有散在的零星发光; 而pEGFPN1质粒转染组的细胞则呈整体（均匀）荧光反应， 无胞质与胞膜之分（图5）。提取的转染后HEK 293细胞的膜蛋白和可溶蛋白， Western blot结果示可溶蛋白和对照组未检测出相应蛋白， 而在24 h和48 h膜蛋白中在Mr约94 000处可见显影带， 提示在HEK293细胞膜中有GPC3hAFP542-550EGFP表达（图6）。

3 讨论

　　人类T细胞系统可以通过MHC I类分子识别AFP来源的短肽产生抗肝癌作用［2， 3］， 已将AFP免疫T细胞后获得的CTL细胞注入小鼠已观察到其在体内的抗癌的作用［4］。但是在体内AFP作为“自身”肿瘤性抗原机体对其表现为免疫耐受。“锚定蛋白”是一种一端带有锚定信号膜蛋白的通称， 共价连接天然的糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphophatidylinositol， GPI）是细胞表面糖蛋白锚定细胞膜的重要方式， 其疏水端的分支信号序列翻译后可以嵌入膜的脂质双分子层中， 也称之为GPI锚定蛋白质［5］。

　　理论上说任何蛋白质都可以通过嵌合cDNA的办法将其3′末端的基因序列由天然的GPI锚定蛋白质的3′端替换， 而转变为GPI 锚定蛋白“派生”蛋白， 即新的“GPI再锚定蛋白”（GPIreanchored protein）。当其表达后应当同样具备“锚定”细胞膜的特性， 这种技术就是“蛋白质工程（protein engineering）”［6］。近年来该技术逐步发展并应用于细胞肿瘤疫苗和免疫基因治疗中， 如GPI连接B7.1在小鼠中诱导保护性免疫并在体外诱导同源抗肿瘤T细胞增殖［7］; 将白介素2和12（interleukin 2 and12）锚定在肿瘤细胞膜上激发强的抗肿瘤免疫反应［8］。

　　glypican 3（GPC3）是一种新型原发性肝癌的肿瘤标记物， 是一类GPI膜锚定糖蛋白。在肝癌细胞膜上过表达， 锚定于肝癌细胞膜且可以分泌入血， 其氨基酸序列的N端决定其分泌， 而C端是其锚定信号［9］。本研究根据GPC3蛋白质信息将其基因分段克隆， 强抗原决定簇hAFP542-550的基因片段（afp542-550）嵌合在GPC3的N端分泌信号后， 同时为了示踪检测将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的基因嵌合在hAFP542-550和GPC3的C端之间， 三者共同组建质粒pGPC3EGFP， 期望该质粒能在肝癌细胞表达融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP， 且短肽hAFP542-550能够随同融合蛋白分泌并锚定到细胞膜表面， 分泌信号肽切除后， hAFP542-550暴露于癌细胞膜表面， 使单个肝癌细胞成为带有多个hAFP542-550短肽的抗原颗粒， 从而有效活化T细胞系统被效应T细胞识别杀伤。

　　首先从RNA和蛋白质水平分别证实了该融合蛋白可以在肝癌细胞HepG2中表达。接着以EGFP基因来源质粒pEGFPN1作为对照， 转染HepG2细胞， 在24 h和48 h荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达， 发现两者的表达部位不同， 融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP表达较pEGFPN1的EGFP表达效率要低， 但是可以明显发现GPC3hAFP542-550EGFP的表达主要集中在细胞轮廓周边， 即膜部位， 并且有成“斑”或成“帽”现象， 此外在细胞内有零星散在， 推测可能是细胞内质网和/或高尔基体上的， 与绿色荧光蛋白合成通路有关。这些发现与蛋白质工程技术理论初步吻合。为了进一步证实该融合蛋白是表达在细胞膜上， 选取无内源表达AFP和GPC3的人胚肾293细胞， 分别提取转染后不同时段的细胞膜蛋白和可溶蛋白， 进行细胞组份研究， 研究结果亦显示， 空白细胞对照组的可溶蛋白和膜蛋白中均没有检测到融合蛋白表达; 实验组可溶蛋白没有检测到融合蛋白表达， 但是在不同时段的膜蛋白中均有融合蛋白表达， 说明pGPC3EGFP质粒表达的融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP仍定位表达在细胞膜， 是一种新的GPI再锚定蛋白。

　　随着对GPC3蛋白质结构和功能深入研究， 选取GPC3基因中分泌信号和锚定信号等功能元件， 去除无关基因再构建融合蛋白也可增加其表达效率， 为下一步诱导活化T细胞功能的研究奠定基础。

参考文献

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