克隆的BKCa通道介导AngⅡ诱导的HEK293细胞增殖

　　　　 作者：李军， 邓昌磊， 李全， 余志斌， 常耀明， 刘立， 谢满江

【摘要】 目的: 探讨BKCa通道在AngⅡ诱导细胞增殖过程中的调控作用。方法: 以脂质体转染法将人源性BKCa通道α亚基（hSloα）转染到HEK293细胞中（HEK293hSloα）， 用MTT法测定AngⅡ诱导细胞增殖的量效曲线， 用免疫细胞化学方法、 流式细胞术分别观察AngⅡ、 IBTX及AngⅡ＋IBTX对HEK293hSloα细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达和细胞周期的影响。结果: AngⅡ可剂量依赖性诱导HEK293hSloα细胞增殖， AngⅡ促进HEK293hSloα细胞PCNA表达， 并使S期细胞比率增加。但此作用能被BKCa通道特异性抑制剂IbTX所阻断。结论: BKCa通道可介导调节AngⅡ诱导的HEK293hSloα细胞增殖过程。

【关键词】 BKCa通道; HEK293hSloα细胞; AngⅡ; 增殖

　　［Abstract］ AIM: To investigate the mediating and regulating role of BKCa channels in AngⅡinduced cell proliferation. METHODS: Using LipofectamineTM 2000， the pIREShSloα plasmid was transfected into HEK293 cells. The concentrationdependent cuve of AngⅡinduced cell proliferation was tested by MTT colorimetry. The effect of IbTX， AngⅡ， AngⅡ+IbTX on the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression and cell cycle of transfected HEK293hSloα cells were detected by immunocytochemistry and flow cytometry， respectively. RESULTS: AngⅡ induced proliferation of transfected HEK293hSloα cells in a concentrationdependent manner. PCNA expression of transfected HEK293hSloα cells was enhanced by AngⅡ， and the percentage of S phase HEK293hSloα cells was increased after AngⅡ treatment. However this effect was inhibited by IbTX， a selective BKCa channel blocker. CONCLUSION: BKCa channels play an potential role in mediating AngⅡinduced proliferation of HEK293hSloα cells.

　　［Keywords］BKCa channel; HEK293hSloα cell; AngⅡ; proliferation
大电导钙激活钾通道（largeconductance calciumactivated K+ channel， BKCa）在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）膜上表达丰富， 其门控特性受细胞膜电位与细胞内Ca2+双重调控， 因而对血管功能与结构起着重要的调控作用 ［1］。VSMC的BKCa通道蛋白复合物由形成孔道的α亚基与具有调节作用的β1亚基组成， NO与AngⅡ等许多血管活性物质的作用靶点都位于BKCa通道的α与β1亚基上， 而且众多蛋白激酶（cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶， 蛋白激酶C以及酪氨酸激酶Ⅱ）， 钙火花、 G蛋白以及许多细胞内蛋白质的相互作用（GTPγS）都可通过BKCa通道发挥作用［1］。最近的研究亦表明， BKCa通道异常不仅影响血管的收缩功能， 还可能通过调控VSMCs凋亡与增殖参与了血管的结构重塑。

　　血管结构重塑涉及VSMCs的增殖、 凋亡、 炎症及纤维化等过程。一般认为， 血管紧张素Ⅱ(AgnⅡ)作为一种重要的血管活性收缩物质可刺激VSMCs的增殖并使VSMCs向血管内膜迁移， 但其诱导VSMCs增殖的机制目前还不甚清楚。由于BKCa通道可通过PKC与Ca2+调控AngII的信号转导通路［2， 3］， 但“BKCa通道是否介导调节了AngⅡ诱导的VSMCs增殖”目前尚未见文献报道。

　　由于VSMCs膜上存在众多类型的离子通道， 相互作用复杂， 很难对某一通道进行孤立的研究。研究表明， HEK293细胞膜上存在的内源性通道很少， 因而作为一种有效的真核表达系统被广泛地应用于外源性离子通道的研究中。我们将人BKCa通道功能性α亚基基因（hSloα）通过脂质体法转染到HEK293细胞中， 通过免疫细胞化学方法与流式细胞术（FCM）观察BKCa通道在AngⅡ诱导细胞增殖过程中的调控作用。

1 材料和方法

　　1.1 材料 携带BKCa通道α亚基cDNA的重组质粒pIREShSloα(Clontech)及表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pEGFP承蒙英国Leicester大学Lippiat JD博士馈赠。人胚肾293细胞株（human embryonic kidney293 cells， HEK293）由第四军医大学免疫学教研室王涛博士提供。限制性内切酶EcoRⅤ， Xho I和BglⅡ购自Fermentas公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自TIANGEN 公司。Biospin质粒DNA小量提取试剂盒购自Bioer公司。DMEM培养液， 胎牛血清（FBS）及胰岛素－转铁因子－硒补充剂（ITS）购自GIBCO公司， 脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。小鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)Ab、 HRP羊抗小鼠IgAb购自Santa Cruz公司。AngⅡ、 iberiotoxin （IbTX， BKCa通道α亚基特异性阻断剂）购自Sigma公司。FCM检测使用第四军医大学免疫学教研室BD FACS Aria流式细胞仪。

　　1.2 方法

　　1.2.1 质粒的扩增与鉴定 编码BKCa通道α亚基的cDNA， hSloα被克隆在pIRES载体的多克隆B位点， 内核糖体进入位点（IRES）序列的下游区， 此序列能使同一mRNA上的连续两个开放读码框转录。将含有氨苄青霉素抗性基因的重组质粒pIREShSloα 转化至DH5 感受态细胞进行复制扩增。转化细胞在LB固体培养基上37℃过夜培养后挑选克隆至含有氨苄青霉素的LB液体培养基中， 37℃摇床过夜。扩增得到的质粒DNA用Biospin质粒DNA小量提取试剂盒提纯， 并用特异性核酸内切酶EcoRⅤ/XholⅠ或EcoRⅤ/BglⅡ对重组质粒pIREShSloα行双酶切（37℃， 2 h）， 10 g/L凝胶电泳鉴定。

　　1.2.2 质粒转染 HEK293细胞接种于DMEM＋100 mL/L FBS培养液中， 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养， 取处于对数生长期的细胞进行实验。转染前24 h将细胞消化接种， 当细胞生长至80％汇合时， 将重组质粒pIREShSloα和表达GFP的质粒pEGFP用脂质体Lipofectamine2000共转染HEK293细胞（脂质体与质粒DNA的用量比是10 μL∶4 μg， 其中pIREShSloα与pEGFP的用量比为10∶1）。转染18 h后更换培养液， 24 h后以600 mg/L G418进行抗性标记筛选， 用荧光显微镜观察GFP报告基因的表达。

　　1.2.3 MTT法确定AngⅡ诱导细胞增殖的量效曲线 将转染的HEK293hSloα细胞以1×104个细胞/每孔的密度接种于96孔板， 培养液为DMEM＋30 mL/L FBS＋10 mL/L ITS， 每孔100 μL。实验分5组， 四个实验组AngⅡ浓度分别为1、 10、 100、 1000 nmol/L， 对照组不加药。培养18 h后每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L）， 继续培养4 h后选择490 nm波长， 在酶联免疫检测仪上读取A值， 绘制细胞生长的量效曲线。

　　1.2.4 免疫细胞化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达 将转染的HEK293hSloα细胞接种在24孔培养板， 培养液为DMEM＋30 mL/L FBS＋10 mL/L ITS， 实验组中分别加入IbTX、 AngⅡ、 AngⅡ+IbTX， AngⅡ终浓度为100 nmol/L， IbTX终浓度为100 nmol/L; 对照组不加任何药物。24 h后将细胞用950 mL/L乙醇固定20 min， 10 mL/L TritonX100(PBS)作用30 min， PBS浸泡漂洗2次， 每次5 min， 入30 mL/L h3O2去离子水作用10 min后PBS洗脱， 再用10 g/L BSAPBS作用60 min后吸去封闭液。加入1∶50小鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)Ab， 4℃过夜， PBS浸泡漂洗2次， 每次5 min。再加入HRP羊抗小鼠IgAb， 于37℃下30 min， PBS浸泡漂洗2次， 每次5 min。DAB显色5　　min， 再用苏木精衬染， 10 mL/L氨水反蓝后在显微镜下观察结果并拍照。每组选取6孔， 计数每孔10个不同高倍视野下的PCNA阳性细胞数。

　　1.2.5 FCM测定细胞周期 将转染的HEK293hSloα细胞接种在6孔培养板， 培养液为DMEM＋30 mL/L FBS＋10 mL/L ITS， 实验组中分别加入AngⅡ、 AngⅡ+IbTX， 各药物终浓度同前; 对照组不加任何药物。培养24 h后， 消化收获并洗涤离心， 用无水乙醇固定， 加入PI溶液（50 mg/L PI、 1 mL/L TritonX100、 0.1 mmol/L EDTA及50 mg/L RNase A）染色30 min， 然后用流式细胞仪（BD FACS pa）分析DNA的含量。

　　1.2.6 统计学分析 数据采用Origin进行处理， 两组间的比较采用t检验。以P&<0.05为有统计学意义。

2 结果

　　2.1 质粒的酶切鉴定与细胞转染效率 pIREShSloα的全长为9 622 bp， 为了确定插入的BKCaα亚基cDNA的大小及位点， 扩增得到的重组质粒经EcoR V/Bgl II双酶切后得到大小为2 255 bp和7 367 bp的片段， 经EcoR V/Xhol I双酶切后得到大小为1 159 bp和8 463 bp的片段。经琼脂糖凝胶电泳的DNA片段大小证明目的基因片段成功插入载体的相应位点（图1）。用G418筛选pIREShSloα转染的HEK293细胞， 用荧光显微镜检测GFP报告基因的表达， 结果显示GFP高表达于与pIREShSloα共转染的HEK293细胞上（图2）。

　　2.2 AngⅡ浓度依赖性诱导HEK293hSloα细胞增殖 用MTT比色法检测AngⅡ浓度分别为0、 1、 10、 100、 1 000 nmol/L， 培养24 h后HEK293hSloα细胞生长情况， 以A490值为纵坐标， AngⅡ浓度为横坐标绘制量效曲线。结果显示AngⅡ可浓度依赖性诱导HEK293Sloα细胞增殖， 浓度为100 nmol/L时促细胞增殖作用最强（图3）。

　　2.3 IBTX抑制AngⅡ诱导的HEK293hSloα细胞PCNA表达 采用PCNA免疫细胞化学染色方法观察IbTX、 AngⅡ及AngⅡ+IbTX 对HEK293hSloα 细胞PCNA表达的影响， 图4显示各实验组细胞PCNA表达情况。单独IbTX组PCNA阳性率与对照组相比没有明显差别， 表明IbTX对HEK293hSloα 细胞无明显药物毒性等影响。AngⅡ组PCNA阳性率最高（16.45％）， 与对照组相比有统计学意义（P&<0.01， 图5）; AngⅡ+IbTX 组PCNA阳性率（9.45％）与AngⅡ组相比有明显差异， 说明AngⅡ诱导的HEK293 hSloα细胞增殖作用能被BKCa通道特异性阻断剂IbTX所阻断（P&<0.01， 图5）。

　　2.4 IBTX对AngⅡ诱导的HEK293 hSloα细胞周期的影响 HEK293 hSloα细胞在AngⅡ（终浓度为100 nmol/L）作用24 h后， S期细胞比率明显增加， 达54.6％。而AngⅡ+IbTX组与AngⅡ组相比， 其G1期细胞比率相对增加， 而S期细胞比率降低至43.6％， 说明IbTX抑制了HEK293 hSloα细胞从G1期向S期的转换， 并且明显降低了G2期细胞的百分数， 从而阻滞细胞的有丝分裂（图6）。图4 各实验组PCNA阳性细胞的比较

　　3 讨论

　　VSMCs膜上存在众多的离子通道， 它们之间相互影响， 交互作用复杂， 因而很难孤立地研究某一通道的特性。研究表明， HEK293细胞不表达内源性BKCa通道， 而且存在的其他内源性通道也很少， 因此作为一种理想的BKCa通道研究模型， 已广泛地应用于离子通道动力学与通道生物化学等研究中［4］。在本实验中， 我们将BKCa通道功能性 亚基瞬时转染到HEK293细胞中， 转染效率超过90％， 并且通过膜片钳记录到HEK293hSloα细胞的外源性BKCa通道电流， 转染结果可靠， 与文献报道一致［5］。

　　通过MTT法证实AngⅡ可浓度依赖性诱导HEK293hSloα细胞增殖（图3）， 并且在100 nmol/L的实验浓度下， AngⅡ可显著增加HEK293 hSloα细胞PCNA的阳性表达率（图4）。BKCa通道特异性阻断剂IbTX单独作用对HEK293hSloα细胞增殖没有影响， 但IbTX可显著降低AngⅡ诱导的细胞PCNA阳性表达（图5）。流式细胞术检测证实IbTX抑制AngⅡ诱导的细胞增殖是由于其显著抑制了G1期细胞向S期的转换， 并且明显降低了G2细胞的百分数， 从而阻滞细胞的有丝分裂（图6）。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种Mr 36 000核蛋白， 在G1期PCNA的表达逐渐增加， S期达最高峰， 而G2/M期则减少。PCNA的表达可能是DNA多倍体形式表达的一个标记， 其合成及表达与细胞的增殖状态、 分化活跃程度有关， 可以客观评价细胞增殖状态。本实验中我们采用免疫细胞化学检测PCNA的阳性表达， 并且结合FCM检测细胞周期， 因此在方法学上比较全面地评价了细胞增殖作用。

　　AngⅡ作为一种重要的血管活性物质在高血压、 动脉粥样硬化、 心肌肥厚与心衰等心血管疾病中有着重要的作用［6］。已有的研究表明， 一方面， AngⅡ可通过促进细胞膜去极化与细胞内Ca2+浓度的增加而诱导细胞增殖［6］; 另一方面AngⅡ也可通过1型受体（AT1）活化PKC与c Src酪氨酸激酶， 从而激活ERK1/2信号途径促进细胞的增殖［2， 3］。而AngⅡ对BKCa通道的作用比较复杂， AngⅡ可通过AT1受体抑制BKCa通道的活性， 而通过2型受体（AT2）激活BKCa通道的活性［7， 8］。在HEK293细胞实验中则发现cSrc通过磷酸化BKCa通道 亚基而使BKCa通道活性增强［9］。在成纤维细胞［10］与神经胶质瘤细胞［11］中均发现BKCa通道的激活是EGF与PDGF诱导细胞有丝分裂的必要条件， 而BKCa通道特异性阻断剂charybdotoxin（ChTX）可有效阻止有丝分裂的激活。本实验中， 由于转染的HEK293细胞是否有内源性AT1或AT2受体表达还不清楚， 因而我们认为AngⅡ通过引起胞内Ca2+的增加或HEK293细胞内cSrc的活化而活化转染的BKCa通道， BKCa通道活性的增强是AngⅡ诱导细胞进入有丝分裂的必要条件［10， 11］， 而当IbTX阻断BKCa通道活性后， 即阻止了AngⅡ诱导细胞增殖。

　　值得注意的是， 也有研究表面BKCa通道可介导NO诱导的VSMCs凋亡［12］， 即BKCa通道活性的增强可使细胞内K+耗竭， 从而激活一系列Caspase酶最终引起凋亡。故而BKCa通道有可能作为凋亡与增殖的共同上游分子开关， 由于所使用的凋亡诱导剂或增殖诱导剂的不同从而使BKCa通道发挥不同的作用。

　　通过PCNA免疫细胞化学染色和FCM检测， 显示BKCa通道特异性阻断剂IbTX可显著抑制AngⅡ诱导的HEK293hSloα细胞增殖， 说明BKCa通道对AngⅡ诱导的细胞增殖具有调控作用。但由于实验中只转染表达了BKCa通道功能性的 亚基， 没有探究BKCa通道 亚基和调节性的 亚基共转染后对AngⅡ诱导的细胞增殖的影响， 这是本实验的不足之处; 另外尚未检测BKCa通道介导调节AngⅡ诱导HEK293细胞增殖过程中可能的关键信号分子， 如cSrc等。总之本研究发现BKCa通道介导调节了AngⅡ诱导的HEK293细胞增殖， 为我们进一步在血管平滑肌细胞验证上述实验结果提供了线索、 奠定了基础。

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