间充质干细胞用于类风湿关节炎治疗的理论及应用前景

　　　　　　作者：刘广洋 韩忠朝， 朱德琳

【关键词】 类风湿关节炎; 间充质干细胞; 组织修复; 免疫调节

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一类以慢性多关节滑膜炎、 骨及软骨破坏为主要特征的全身性自身免疫性疾病。病变呈持续性、 反复发作过程， 导致明显的致残率， 是一种常见的多发病， 它可见于所有种族、 发生于任何年龄。RA发病机制尚未完全明确， 目前认为[1-3]自身抗原介导的超敏反应以及非抗原特异性炎症反应是导致破坏性病变的主要原因。研究表明[2， 3]， B细胞作为抗原提呈细胞与自身抗原如II型胶原蛋白(CII)等相结合， 激活T细胞产生免疫应答， 随之巨噬细胞、 单核细胞被激活， 并分泌TNFα、 IL1和IL17等[3]炎症因子， 这些细胞因子进一步诱导IL6、 IL8等细胞因子的生成， 同时激活关节软骨周围的金属蛋白酶(MMP)、 释放滑膜成纤维细胞和破骨细胞， 后者分泌降解糖蛋白和胶原的多种酶， 从而导致关节组织破坏。

　　传统治疗RA药物主要包括非甾体抗炎药物(NSAIDs)和慢作用抗风湿药(SAARDs)等， 副作用明显， 常引起胃肠道副作用， 少数有肾脏损害、 骨髓抑制、 精神障碍。近年来兴起的生物治疗方法广泛应用于临床， 其中针对细胞因子靶向治疗的TNFα抑制剂， 如TNFα竞争抑制剂Etanercept和TNFα单克隆抗体Infliximab等是近年使用最为广泛的生物制剂， 具有抑制滑膜细胞增生， 减少炎症细胞因子释放， 从而达到抗炎和改善RA病情的作用。然而Giles等[4]研究发现， 使用TNFα抑制剂易发生各种手术后感染， 且对损伤关节无显著修复能力， 因此限制了其临床使用。目前随着组织细胞工程学和基因工程学的发展， 对于干细胞的研究已成为RA治疗的热点， 其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)以其多向分化能力、 免疫抑制性能以及组织损伤修复能力和低风险性， 为RA的治愈提供了新的前景[5]。

　　1 MSCs的来源及特性

　　MSCs是干细胞家族的重要成员， 来源于早期的中胚层和外胚层， 最初在骨髓中发现， 具有多向分化潜能、 造血支持和促进干细胞植入、 免疫调控和自我复制等特点。

　　1.1 MSCs的定义 130年前， 德国病理学家Cohnheim在研究伤口修复时， 就提出骨髓中可能存在非造血组织的干细胞。直到1976年， Friedenstein等[6]才首次报道， 骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落。后来的研究表明Friedenstein粗糙分离所得到的细胞是多能的， 可分化为成骨细胞、 软骨细胞、 脂肪细胞和成肌细胞。因此， 骨髓基质中的这种多能细胞， 由于能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞， 而被称为间充质干细胞。后来人们陆续发现， 除骨髓外， 在脐带、 脐血、 脂肪及胎盘等多种组织均发现有MSCs的存在。

　　MSCs在形态上呈纺锤形的成纤维细胞状， 能附着在塑料或玻璃培养皿上生长形成均匀的集落或贴壁的融合层。由于来源不同， 细胞分离扩增的方法存在差异， 为此， 国际细胞治疗学会(ISCT)制定了界定MSCs的三条基本标准[7]: (1)帖壁生长; (2)具有以下表型特征: ≥95%的细胞表达CD105， CD73和CD90等， 而绝大多数不表达CD45、 CD34、 CD14、 CD11b、 CD79a 及CD19等， 也不表达MHC II类分子， 如HLADR抗原等。(3)具有分化为成骨细胞、 脂肪细胞、 成软骨细胞等3类细胞的能力。

　　1.2 MSCs的分化及组织损伤修复 间充质干细胞具有多向组织分化潜能， MSCs植入宿主体内后可在特定部位的微环境影响下向正确表型的细胞分化。研究表明[8-10]， MSCs在体内外可以分化成为成骨、 软骨、 脂肪、 腱、 肌肉和骨髓基质等间充质组织， 因此可以作为组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。动物实验和临床研究结果证实MSCs可以修复受损心肌、 肾组织、 软骨及膝关节半月板等。当组织损伤发生后， 损伤组织可释放引多种趋化因子， 同时表达特异性受体或配体， 引导对应的干细胞迁移并黏附于损伤处， 产生自然的代偿性修复; 而通过各种途径引入体内的外源性MSCs也会定向归巢至损伤处， 发挥治疗作用[10]。Gao等[9]报道了利用MSCs构建骨、 软骨联合移植物的可行性。利用大鼠骨髓MSCs体外诱导分化为软骨和成骨， 将生成的软骨和成骨分别吸附于透明质酸衍生物(Hyaffll)构成的海绵状支架和多孔磷酸钙陶瓷， 植入同基因软骨缺损的大鼠皮下， 结果证实在固体支持物中加入MSCs可以促进缺损软骨成功修复。

　　1.3 MSCs的免疫抑制功能 MSCs具有显著的免疫调节功能。大量的研究证实， 在体内MSCs可调节B细胞、 T细胞免疫应答能力， 抑制NK细胞增殖、 细胞因子分泌以及细胞毒性作用， 起到抗炎、 抑制自身免疫疾病、 减弱移植治疗过程中的排斥反应等作用[11-13]。

　　MSCs免疫调节的研究结果显示出不同的作用机制， 目前的多数观点认为: MSCs需要与淋巴细胞动态的免疫应答才能产生抑制作用， 而MSCs与T细胞之间的接触虽然可以增强其抑制作用但并非必需， 可能需要转化生长因子β (TGFβ)、 吲哚胺2， 3双加氧酶(IDO)和肝细胞生长因子(HGF)等可溶性因子的参与。而MSCs在IFNγ和TNFα(或IL1α/β)等炎症因子刺激下可释放趋化因子诱导T细胞聚集于MSC周围， 并通过升高NO水平、 产生PGE2、 HLAG IL10等因子而起免疫抑制作用[14]。

　　近年来的研究发现MSCs有希望成为临床治疗自身免疫病的一种有效手段。Kassis等[11]用MSC治疗自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型小鼠， 结果显示MSC可抑制髓磷脂特异T淋巴细胞增殖。Okada等[12]将MSCs移植入自身免疫性心肌炎(AM)小鼠模型体内， 结果发现MSCs可通过诱导心血管生产和抑制炎性细胞因子同时表达HGF而减轻病症。Blanc K等[13]的研究则表明， MSCs能抑制T细胞增殖且不受MHC的限制， 无论是来自供体、 受体或第3者的MSCs均具有相似的免疫调节作用。同时MSCs进行治疗是安全的， 临床无毒副作用。

　　2 MSCs在RA治疗的研究进展

　　MSCs的多向分化潜能、 组织损伤修复以及免疫调控能力， 为RA等自身免疫性疾病的治疗提供了坚实的理论支持。然而关于MSCs治疗RA的研究， 目前大多处于临床前研究阶段。

　　2.1 MSCs用于RA治疗的模型动物研究 目前最常用到的关节炎动物模型是关节炎小鼠 (CIA)， 建立方法是通过II型胶原蛋白(CII)结合弗氏完全佐剂(CFA)皮内注射DBA/1小鼠， 从而诱发小鼠关节炎。此模型与人类风湿关节炎临床症状相似， 为RA的研究奠定了基础。

　　Mutafchieva等[15]发现关节炎小鼠关节滑液增生， 大的圆形细胞表达骨成型蛋白受体(BMPRs)， 此蛋白可作为骨髓MSCs向滑液转移的信号。提示关节病变可促进MSCs向关节滑膜的聚集从而修复损伤的组织。Djouad等[16]利用不同剂量鼠源MSCs细胞系治疗关节炎小鼠， 结果发现MSCs没有表现出显著临床功能; 而Augello等[17]使用原代鼠源MSCs代替MSCs细胞系， 在诱导小鼠关节炎的同时腹腔注射原代鼠源MSCs。结果显示， 单次注射MSCs可预防骨和软骨的严重不可逆性损伤， 杀伤性T细胞增殖被抑制、 炎性细胞因子如TNFα、 IFNγ等表达量显著降低， 同时调节性T细胞及IL10和IL4等调节性细胞因子分泌增多。提示MSC细胞系与原代细胞相比， 其分化潜能及免疫调节能力有所降低; 另外MSCs免疫时间对炎症的抑制效果也起重要作用， MSCs似乎对RA的预防比对RA的治疗效果更明显。

　　2.2 MSCs用于RA治疗的细胞学研究 MSCs在体内可产生基体间质蛋白如II型胶原蛋白(CII)， 而CII是透明软骨的组成部分， 在RA病程中作为自身抗原引起自身免疫反应[4]， 因此有必要证明MSCs在RA病理反应过程中是否具有抑制CII激活的特异性T细胞免疫反应的能力。Zheng等[18]从RA患者外周血和滑膜液中选取对CII刺激具有特异阳性反应的T细胞， 并与正常捐献者提供的人骨髓MSCs共培养， 结果发现当T细胞被CII刺激后， MSCs可抑制T细胞增殖， 而抑制程度与MSCs的剂量曾正相关; 同时T细胞产生IFNγ和TNFα被抑制， 而IL10和IL4分泌增多。最近Dudics等[19]通过对RA患者体内骨髓MSCs体外培养， 发现与正常捐献者MSCs相比， RA患者MSCs有一定的克隆受损和增殖潜能限制， 但仍然具有增殖和分化潜力， 并且具有修复关节组织损伤的能力。提示可利用患者自身MSCs通过体外培养扩增， 回输患者体内从而起到治疗的目的。

　　3 结语

　　综上所述， 间充质干细胞因其具有较好的免疫抑制能力和组织损伤修复能力， 在类风湿关节炎等疾病的治疗中表现出良好的前景。大量的试验表明， MSCs被TNFα、 IFNγ及IL1β等细胞因子激活后， 可通过与淋巴细胞直接接触或通过分泌如细胞因子、 IDO、 PGE2及NO等多种可溶性因子， 从而抑制淋巴细胞活性， 减轻淋巴细胞引起的炎症反应及对软骨、 关节组织的破坏[18]; 同时， MSCs的组织修复能力也为其恢复遭关节炎破坏的软骨及关节组织起到重要作用。

　　不过， 对于类风湿关节炎的治疗MSCs还存在一些不确定性。比如， MSCs在体内可表达基体间质蛋白如II型胶原蛋白(CII)， 而CII则被认为是引起类风湿关节炎自身免疫反应的自身抗原。虽然体外增殖实验及动物试验证实MSCs可抑制CII介导的T淋巴细胞增殖， 但其安全性和可靠性尚有待进一步的临床研究确定。同时研究还发现注射时间、 细胞来源、 动物模型系统、 及检测精确性等各种因素可能导致不同的结果。另外， 目前应用于类风湿关节炎研究的间充质干细胞多数来源于骨髓， 而对于MSCs其他的来源， 如脐带间充质干细胞(hUMSC)等， 较之骨髓间充质干细胞(BMMSC)增殖潜能更大、 取材更方便、 免疫调节能力更加显著， 因此在治疗RA等自身免疫性疾病方面具有更有优势的临床潜力。

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