肝型脂肪酸结合蛋白和脂肪酸合成酶在乳腺浸润性导管癌的表达变化及其意义

　　　　 作者：李华， 吕青 薛晖， 陈红

【摘要】 目的: 探讨肝型脂肪酸结合蛋白（LFABP）和脂肪酸合成酶（FAS）与乳腺浸润性导管癌发生发展的关系。方法: 用半定量逆转录聚合酶链反应、 免疫组织化学和Western blot等方法检测LFABP、 FAS和血管内皮生长因子（VEGF）在86例乳腺浸润性导管癌中的表达变化。结果: LFABP和FAS主要分布于浸润性导管癌的腺泡和导管上皮细胞， LFABP的mRNA和蛋白质的表达量在Ⅲ级浸润性导管癌的较Ⅰ、 Ⅱ级明显上调（P&<0.05）。相反， FAS的表达量在Ⅲ级浸润性导管癌的较Ⅰ、 Ⅱ级明显下调， 两者的表达无明显相关性（P&>0.05）。但是， LFABP的表达与VEGF呈明显相关性。结论: 在Ⅲ级浸润性导管癌， 随着FAS表达下调， LFABP和VEGF的表达上调。

【关键词】 基因和蛋白质表达; 肝型脂肪酸结合蛋白; 脂肪酸合成酶; 乳腺癌

肝型脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid binding protein， LFABP)是首次从肝中克隆出来的小分子蛋白质， 相对分子质量（Mr）约15 000。有研究发现， LFABP在肝细胞癌和肝母细胞瘤中呈过度表达， 在乳腺癌细胞株MCF7和T47D［1］和前列腺细胞株DU145［2］的表达较正常乳腺细胞株明显上调， 在乳腺浸润性导管癌组织的表达量较纤维腺瘤明显增加［3］， 提示LFABP与肿瘤的密切关系。

　　脂肪酸合成酶（fatty acid synthase， FAS）在哺乳动物的内源性脂肪酸合成中起的关键作用。FAS合成产物有棕榈酸盐（80%）、 豆蔻酸盐（10%）和硬脂酸盐（10%）， 在人多数恶性肿瘤中呈过度表达， 被认为是不良预后的分子标志。最近很多证据显示， FAS不但可整合与癌细胞代谢、 增殖和存活有关的信号传导通路， 还通过调节与恶性特征有关的Her2/neu(erbB2)、 ER等癌蛋白， 在肿瘤发展中扮演着重要的角色。作为结合及转运长链脂肪酸的LFABP与FAS， 其在乳腺癌中的作用及其相互关系尚不清楚。

　　大部分的脂肪酸结合蛋白与长链脂肪酸以1∶1的比例结合， 但是1摩尔的LFABP可结合2摩尔的长链脂肪酸以及乙酰基辅酶A、 溶血磷脂、 亚铁血红素和胆汁盐等疏水性配体。鉴于LFABP在恶性肿瘤中的表达及其与脂肪酸的亲和能力， 我们检测了LFABP和FAS在乳腺浸润性导管癌的表达变化以及它们与临床病理指标的关系。此外， 由于脂肪酸是通过血液运输的， 我们还探讨了LFABP的表达与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF)的关系。

1 材料和方法

　　1.1 材料 2005-05/2007-03在四川大学华西医院乳腺外科收集浸润性导管癌标本86例（表1）， 年龄38～67岁（51.28±8.21岁）， 患者术前未经化疗或放疗。术中所取标本经患者知情同意。所取标本均立刻置于液氮中保存备用。组织/细胞总RNA提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。逆转录试剂盒（Revert AidTM first strand cDNA synthesis kit）购自Fermentas公司。PCR反应预混液购自TaKaRa公司。小鼠抗人LFABP抗体购自R&&D公司。兔抗人FAS、 VEGF、 βactin和辣根标记山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG（用于Western blot）购自Santa Cruz公司。APES、 DAB和过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒SP9001、 SP9002（用于免疫组织化学染色）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。即用型SABC免疫组化染色试剂盒SA1025购自武汉博士德生物工程有限公司。PVDF膜购自Millipore公司。增强型化学发光试剂盒购自Pierce公司。表1 患者的主要临床病理学资料

　　1.2 方法

　　1.2.1 RTPCR检测 总RNA提取及cDNA的逆转录严格按照相应的试剂盒中的说明操作。用TaKaRa公司设计、 合成的引物进行目的片段的PCR扩增。引物序列见表2。对不同样本， 用紫外分光光度计（Eppendorf）测定cDNA浓度， 取等量cDNA进行PCR反应。25 μL反应体系中含cDNA 模板1 μL， PCR预混液12.5 μL， 目的基因上、 下游引物（0.5 μmol/L）各1 μL， 反应共28个循环。对RTPCR产物进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像系统观察照相， Quantity One软件测定目的条带与βactine的光密度比值。表2 LFABP、 FAS、 VEGF和ACTIN基因RTPCR反应的引物序列

　　1.2.2 免疫组织化学染色 APES处理玻片， 石蜡切片常规脱蜡至水， 一抗LFABP的浓度为1∶50， 其余为1∶100， 以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。染色步骤参照试剂盒， DAB显色。阳性细胞百分数记数: 400倍镜头下取五个不同的视野， 对每一视野连续计数100个细胞， 记录其中阳性细胞数， 取平均数。

　　1.2.3 Western blot 分析 取50～100 mg组织， 液氮下研细， 取1 mL裂解液 （7 mol/L尿素， 40 g/L CHAPS (3［(3Cholamidopropyl)dimethylAmmonio］1Propanesulfonate)， 40 mmol/L DTT， 100 mol/L 苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride， PMSF）， 0.05 g/L RNA酶， 0.2 g/L DNA酶， 0.01 g/L溴酚蓝）与组织充分混匀， 4℃放置15 min， 16 000 g， 4℃离心40 min， 收集上清。测定每个样品的蛋白浓度。样品与1×SDS上样缓冲液（5×SDS上样缓冲液: 0.5 mol/L TrisHCl， pH6.8， 2.5 mL; 0.81 g/L DTT， 0.1 g/L SDS， 0.05 g/L溴酚蓝， 甘油2.5 mL）1∶1混匀， 100℃变性5 min。每孔加样30 μg。在40 g/L积层胶、 120 g/L分离胶中80 V分离蛋白质条带。200 mA半干转25 min(6.5 cm×8.5 cm PVDF膜)。膜分别与一抗LFABP（1∶600）、 FAS（1∶800）、 VEGF（1∶800）和βactin（1∶800） 4℃孵育过夜， 与二抗（1∶2 000）室温孵育2 h。增强型化学发光试剂盒（Pierce）检测目的条带。Quantity One 软件测定目的条带与βactin条带的光密度比值。

　　1.2.4 统计学分析 用SPSS13.0软件进行统计学分析， 数据以x±s表示， 两组间均数比较用t检验。相关性分析用Pearson检验。P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

　　2.1 RTPCR结果 在86例浸润性导管癌组织中， 均检测到LFABP、 FAS和VEGF mRNA的表达。半定量RTPCR 的结果显示， LFABP和VEGF的表达在Ⅰ、 Ⅱ级浸润性导管癌较低， 在Ⅲ级明显上调（P&<0.05）， 在Ⅰ、 Ⅱ级之间的表达无显著性差异。而FAS的表达在Ⅰ、 Ⅱ级较高， 在Ⅲ级明显下调（P&<0.05， 表3、 图1）。

　　2.2 免疫组织化学染色结果 LFABP和FAS阳性沉淀物分布于浸润性导管癌腺泡和导管的上皮细胞。LFABP和VEGF的阳性细胞百分数在Ⅲ级较Ⅰ、 Ⅱ级明显增多， 而FAS的阳性细胞百分数在Ⅰ、 Ⅱ级较高， 在Ⅲ级明显减少（P&<0.05）， 三者在Ⅰ、 Ⅱ级的阳性细胞百分数均无统计学意义（表3， 图2）。表3 T检验结果显示LFABP、 VEGF和FAS mRNA和蛋白质在ⅠⅢ级浸润性导管癌的表达

　　2.3 Western blot 分析结果 半定量Wetern blot 的结果表明， LFABP和VEGF在Ⅲ级乳腺浸润性导管癌的表达较Ⅰ、 Ⅱ级明显上调。FAS在Ⅰ级浸润导管癌的表达最高， 在Ⅱ级降低， 在Ⅲ级较Ⅰ、 Ⅱ级明显下调（P&<0.05， 表3、 图3）。

　　以上3种方法同时验证， 与Ⅰ、 Ⅱ级乳腺浸润性导管癌相比， FAS在Ⅲ级表达下调， 而LFABP和VEGF表达上调。LFABP的表达与FAS无统计学意义（P&>0.05）， 但是与VEGF的表达有明显相关性（P&<0.05）。LFABP和FAS的表达与年龄、 淋巴结转移、 停经情况和雌、 孕激素受体的表达无关。图3 Western blot检测显示LFABP、 VEGF和AS在ⅠⅢ级乳腺浸润性导管癌的表达变化

3 讨论

　　大量的实验证明， LFABP具有促进肿瘤细胞增殖、 抑制分化的作用。转染了LFABP的肝细胞获得增殖能力。用LFABP的反义寡核苷酸处理DU145前列腺细胞株， 与细胞增殖相关的基因出现下调， 相反， 与细胞凋亡相关的基因上调［2］。用抑癌药物烷化剂2溴丙酮酸（BrPA）处理肿瘤细胞， 细胞增殖受到抑制， LFABP的水平降低［4］。但是， 在结直肠癌中， LFABP的表达随着肿瘤分化程度的降低而降低， 从而被认为是结直肠癌的分化标志［5， 6］。因此， LFABP在不同类型的肿瘤可能有不同作用。我们的结果显示， LFABP在Ⅲ级（低分化）浸润性导管癌的表达较Ⅰ级（高分化）、 Ⅱ级（中度分化）明显上调， 证明LFABP与肿瘤细胞增殖和分化有关。

　　此外， LFABP可结合FAS的末端合成产物棕榈酸盐、 豆蔻酸盐和硬脂酸盐， 两者之间应有密切的关系。但我们的结果表明， LFABP的表达与FAS的表达无相关性。而且， LFABP的表达在Ⅲ级导管癌增高， 但FAS的表达在Ⅲ级降低; LFABP的表达与VEGF相关， 而FAS的表达与VEGF无关。分析有以下几种原因: ①在癌变前期或中期， 微环境缺氧的异常情况下， 氧化作用所需能量可采用FAS途径， 通过消耗还原当量来平衡氧化还原反应， 维持肿瘤细胞的正常功能［7］， 而只有那些对有限的O2耐受的癌细胞才能存活。②随着肿瘤细胞不断增殖， 代谢逐渐增强， FAS的表达却明显下调， 此时细胞可能通过大量表达LFABP来缓解耗氧的压力。很多实验证明， LFABP具有抗氧化作用。过度表达LFABP的细胞系， 其细胞内的活性氧 (reactive oxygen species， ROS)水平和所释放的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）较对照组明显减少［8］， 在单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstrction， UUO）模型中， 梗阻7 d后， 在对照组堆积大量的脂质过氧化作用（lipid peroxidation）产物， 但在转染了LFABP的小鼠中却未检测到脂质过氧化作用产物［9］， 进一步证明LFABP的抗氧化作用。此外， 依赖于FAS的内源性脂肪酸代谢减少的同时， Her2/neu的表达受到抑制。FAS与Her2/neu的功能及相互关系的丧失可激活有利于细胞存活的抗缺氧分子， 促进VEGF上调。另外， 与HFABP、 EFABP相比， LFABP与FAS的末端合成产物棕榈酸盐的亲和力明显降低［10］， 提示， 在高表达FAS的Ⅰ、 Ⅱ级导管癌， 可能由HFABP和EFABP负责运输FAS的合成产物， 随着FAS的表达的减少， E、 HFABP的表达也减少， 细胞代谢所需的脂肪酸由LFABP获取。而LFABP可能主要通过血流摄取细胞增殖所需的外源性脂肪酸［11］。因此， 在Ⅲ级导管癌， 随FAS表达减少， LFABP和VEGF表达同时上调。

　　在Ⅲ级浸润性导管癌， 由于FAS表达的减少， 细胞增殖、 存活和恶性特征的维持有赖于LFABP的持续表达， 以弥补因FAS表达下调导致的氧气和脂肪酸的供应不足。

参考文献

［1］ Hammamieh R， Chakraborty N， Barmada M， et al. Expression patterns of fatty acid binding proteins in breast cancer cells［J］. J Exp Ther Oncol， 2005， 5(2): 133-143.

［2］ Hammamieh R， Chakraborty N， Das R， et al. Molecular impacts of antisense complementary to the liver fatty acid protein (FABP) mRNA in DU 145 prostate cancer cells in vitro［J］. J Exp Ther Oncol， 2004， 4(3): 195-202.

［3］ 李 华， 吕 青， 董立华， 等. 脂肪酸结合蛋白在乳腺组织的表达及意义［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(4): 312-316.

［4］ Rajaraman G， Burczynski FJ. Effect of dexamethasone， 2bromopalmitate and clofibrate on LFABP mediated hepatoma proliferation［J］. J Pharm Pharmacol， 2004， 56(9): 1155-1161.

［5］ Lawrie LC， Dundas SR， Curran S， et al. Liver fatty acid binding protein expression in colorectal neoplasia［J］. Br J Cancer， 2004， 90(10): 1955-1960.

［6］ Pei H， Zhu H， Zeng S， et al. Proteome analysis and tissue microarray for profiling protein markers associated with lymph node metastasis in colorectal cancer［J］. J Proteome Res， 2007， 6(7): 2495-501.

［7］ Hochachka PW， Rupert JL， Goldenberg L， et al. Going malignant: The hypoxiacancer connection in the prostate［J］. Bioessays， 2002， 24(8): 749-757.

［8］ Wang G， Gong Y， Anderson J， et al. Antioxidative function of LFABP in LFABP stably transfected Chang liver cells［J］. Hepatology， 2005， 42(4): 871-879.

［9］ Kamij Ikemori A， Sugaya T， Obama A， et al. Livertype fatty acidbinding protein attenuates renal injury induced by unilateral ureteral obstruction［J］. Am J Pathol， 2006， 169(4): 1107-1117.

［10］ Storch J， Thumser AE. The fatty acid transport function of fatty acidbinding proteins［J］. Biochim Biophys Acta， 2000， 1486(1): 28-44.