CCR5Delta32基因在人PBMC的表达及其对CCR5/CXCR4分子的影响

　　　　 作者：穆士杰， 安群星， 张献清， 陈蕤， 易静， 余瑞

【摘要】 目的: 在人外周血单个核细胞(PBMC)内表达CCR5Delta32蛋白， 研究该蛋白与CCR5和CXCR4分子间是否存在相互作用。方法: 构建pLentiCCR5Delta32慢病毒载体， 包装后产生重组慢病毒。将其转染PBMC， 荧光显微镜观察转染情况， Western blot鉴定目的蛋白表达， 免疫共沉淀检测目的蛋白与CCR5和CXCR4分子间的相互作用。结果: 成功构建了pLentiCCR5Delta32慢病毒载体， 经包装后产生重组慢病毒， 滴度约为5×108 TU/L。将其转染PBMC， 观察到约半数PBMC胞质内有绿色荧光蛋白表达， 经Western blot鉴定有目的蛋白表达。免疫共沉淀结果显示， CCR5Delta32与CCR5、 CCR5Delta32与CXCR4以异源二聚体形式结合， 之间确实存在着相互作用。结论: 成功地构建重组慢病毒载体并将其转染PBMC靶细胞， 观察到目的蛋白与HIV1两类辅受体(CCR5和CXCR4)间确实存在相互作用。这些工作为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础。

【关键词】 CCR5Delta32基因; 外周血单个核细胞; 人类免疫缺陷病毒; 辅受体

获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome， AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)引起的严重传染病， 迄今仍缺乏特别有效的治疗方法。HIV1辅受体及其基因多态性的发现给AIDS的治疗研究带来新的契机。CCR5和CXCR4是HIV1最为主要的辅受体， CCR5辅受体在人群中存在有多种突变， 其中CCR5Delta32是一种最常见、 也是最重要的辅受体突变形式。据调查， CCR5Delta32纯合子突变个体能有效抵制HIV1感染， 其杂合子个体也不易被HIV1感染或感染后病程进展缓慢。我们从CCR5Delta32突变个体获得目的基因并将其克隆至pLenti6/V5DTOPO载体， 经慢病毒包装后转染人外周血单个核细胞(PBMC)， 研究目的基因的表达及其对HIV1辅受 体(CCR5和CXCR4)的作用。这些工作为今后AIDS的基因治疗研究奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 E.coli DH5α菌株和293T细胞为本室保存。载体pUCmT、 pLP1、 pLP2、 pLP/VSVG和pLenti6/V5DTOPO均购自Invitrogen公司。基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司， 胶回收试剂盒购自宝信公司， 质粒快速提取试剂盒购自Promega公司。Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶， 以及限制性内切酶EcoR I、 BamH I和Pst I均购自TaKaRa公司。转染试剂GeneCompanion II购自GeneTrans公司， 培养基DMEM+100 mL/L胎牛血清购自Hyclone公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组慢病毒载体的构建及包装 从CCR5Delta32突变个体外周血提取基因组DNA， 以其为模板利用设计的一对引物进行PCR扩增。将扩增产物克隆至pLenti6/V5DTOPO载体， 随后转化E.coli DH5α宿主菌。碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定及测序。用pLP1、 pLP2、 pLP/VSVG及pLentiCCR5Delta32 4种质粒共转染293T细胞， 获得重组慢病毒液并测定其滴度。

　　1.2.2 重组慢病毒转染PBMC 用淋巴细胞分离液从新鲜外周血中提取PBMC用100 mL/L FCS RPMI1640培养液(含10 mg/L PHA， 100 U/mL rIL2)培养48 h。加入包装好的重组慢病毒液1 mL(5×108 TU/L)， 加入polybrene(6 mg/L)， 感染2～3 h。移除感染上清， 加入新培养液(含PHA和rIL2)培养24 h， 观察转染情况。

　　1.2.3 Western blot鉴定目的蛋白的表达 裂解转染有目的基因的PBMC， 之后行120 g/L SDSPAGE， 结束后将蛋白转移至NC膜上。以抗CCR5Delta32兔血清(本室自制)为一抗， 以鼠抗兔IgGHRP为二抗， 用ECL显色后观察结果。

　　1.2.4 免疫共沉淀验证目的蛋白与CCR5/CXCR4间的相互作用 用重组慢病毒液感染人PBMC， 培养48 h后收集细胞， 用预冷的PBS洗涤2次， 然后加入0.5 mL细胞裂解液作用2 h。结束后于4℃ 12 000 g离心10 min， 收集上清， 加入protein A/G agarose (Santa Cruz Biotechnology) 20 μL， 于4℃预吸附2 h。离心后收集上清， 加入antiCCR5Delta32抗体2 μg， 4℃震摇1 h， 再加入40 μL protein A/G agarose震摇3 h。离心收集沉淀， 用约0.5 mL细胞裂解液洗涤3次， 再加入同体积的2×SDS样品缓冲液煮沸5 min。之后行100 mL/L SDSPAGE， 将蛋白质转移至PVDF膜， 加入相应一抗(mAb antiCCR5或mAb antiCXCR4)及二抗(羊抗鼠IgGHRP)， 用ECL显色后观察结果。

　　 2 结果

　　2.1 重组慢病毒载体的构建及包装 以CCR5Delta32突变个体基因组DNA为模板PCR得到约650 bp的扩增片段(图1)。测序正确后构建pLentiCCR5Delta32质粒， 用包括pLentiCCR5Delta32在内的四种质粒共转染293T细胞， 产生重组慢病毒， 测定其滴度为5×108 TU/L。

　　2.2 重组慢病毒转染PBMC 分离新鲜PBMC， 用PHA及rIL2刺激培养48 h。加入重组慢病毒液感染， 24～36 h后可见约半数靶细胞内有绿色荧光蛋白表达(图2)。

　　2.3 Western blot鉴定结果 以抗CCR5Delta32兔血清为一抗， 鼠抗兔IgGHRP为二抗， 用ECL显色后观察到目的蛋白的表达(图3)。

　　2.4 免疫共沉淀验证目的蛋白与CCR5/CXCR4间的相互作用 以antiCCR5Delta32为沉淀抗体， 以antiCCR5及antiCXCR4为检测抗体， 验证目的蛋白与CCR5/CXCR4间是否存在相互作用。结果表明， CCR5Delta32与CCR5、 CCR5Delta32与CXCR4以异源二聚体形式结合， 之间确实存在着相互作用(图4)。

　　3 讨论

　　HIV1必需与CD4受体及一些必要的辅受体结合， 才能感染进入靶细胞。现已明确， CCR5和CXCR4是HIV1两类最为主要的辅受体， 其中CCR5辅受体在人群中存在有多种突变。CCR5Delta32是一种最常见， 也是最重要的辅受体突变形式。它是由于CCR5辅受体基因在自然进化过程中发生了32个碱基缺失的突变， 即在CCR5基因编码区域第185位氨基酸密码子以后发生了32个碱基的缺失， 导致开放读码框错位， 造成蛋白质翻译的提前终止， 在细胞内产生出一种截短的、 无功能的CCR5Delta32突变蛋白。正常CCR5相对分子质量(Mr)约为46 000， 而这种截短的突变蛋白Mr只有30 000。据调查研究， CCR5Delta32纯合子突变个体能有效抵制HIV1感染， 其杂合子个体也不易被HIV1感染或感染后病程进展缓慢[1， 2]。通过HardyWeinberg测试及其他研究， 这类突变个体其生理及生殖发育等方面均未受到任何影响。据流行病学调查发现， 在美国白人和欧洲后裔中， CCR5Delta32等位基因突变率约为10%左右[3]。在我国， 各民族CCR5Delta32平均突变率还不到0.2%， 而且主要为杂合子突变[4]。从遗传学角度认为， 我国人群普遍对HIV1易感。目前， CCR5Delta32突变个体抗HIV1感染的机理已基本清楚， 可归纳如下: 由于这种突变个体淋巴细胞内产生的CCR5Delta32蛋白， 通过反式显性失活(transdominant negative， TDN)效应抑制细胞表面CCR5和CXCR4两类辅受体的表达， 从而阻止了嗜T、 嗜M及双嗜性HIV1毒株的感染[5， 6]。具体地说， 是细胞内产生的CCR5Delta32突变蛋白， 与胞内新合成的两类辅受体通过异源二聚体形式结合并将之扣押， 使其无法到达细胞表面。经过数天的新陈代谢， 细胞表面两类辅受体就会减少乃至消失， 从而达到抑制各类HIV1毒株感染的作用。

　　这个发现给AIDS的治疗带来新的契机。我们拟通过构建含CCR5Delta32基因的真核表达载体， 体外转染人PBMC或造血干细胞， 通过表达产物与细胞内新合成的两类辅受体(CCR5和CXCR4)结合并将之扣押在胞内， 从而达到同时阻断嗜T、 嗜M及双嗜性HIV1毒株感染的目的。

　　我们成功地将所构建的慢病毒载体pLentiCCR5Delta32转染人PBMC， 并观察到目的蛋白的表达。免疫共沉淀结果显示， CCR5Delta32与CCR5、 CCR5Delta32与CXCR4以异源二聚体形式结合， 之间确实存在着相互作用。这些工作为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础。

参考文献

　　[1] Agrawal L， Jin Q， Altenburg J， et al. CCR5Delta32 protein expression and stability are critical for resistance to HIV1 in vivo[J]. J Virol， 2007， 81(13): 7111-7123.

　　[2] Agrawal L， Lu X， Qingwen J， et al. Role for CCR5Delta32 protein in resistance to R5， R5X4， and X4 human immunodeficiency virus type 1 in primary CD4+ cells[J]. J Virol， 2004， 78(5): 2277-2287.

　　[3] Zimmerman PA， BucklerWhite A， Alkhatib G， et al. Inherited resistance to HIV1 conferred by an inactivating mutation in CC chemokine receptor 5: studies in populations with contrasting clinical phenotypes， defined racial background， and quantified risk[J]. Mol Med， 1997， 3(1): 23-36.

　　[4] Wang FS， Jin L， Hong WG， et al. Low frequencies of CCR5△32 and CCR5m303， but high frequencies of CCR2641 and SDF13’A alleles in indigenous ethnic groups in mainland China[J]. Chin J Sex Transm Inf， 2002， 2(1): 7-12.

　　[5] Marmor M， Sheppard HW， Donnell D， et al. Homozygous and heterozygous CCR5Delta32 genotypes are associated with resistance to HIV infection[J]. J Acquir Immune Defic Syndr， 2001， 27(5): 472-481.

　　[6] Chelli M， Alizon M. Determinants of the transdominant negative effect of truncated forms of the CCR5 chemokine receptor[J]. J Biol Chem， 2001， 276(50): 46975-46982.