【摘要】 目的: 检测乳腺癌患者血浆循环DNA含量， 探讨其与临床病理特征之间的关系。方法: 收集80例乳腺癌、 40例乳腺良性病变患者和97例健康自愿者的外周血。用微量基因组DNA 提取试剂盒提取血浆DNA， 用荧光染料试剂盒和QubitTM荧光仪测定血浆DNA含量。结果: (1)血浆循环DNA含量在组织学分级Ⅰ级和Ⅱ～Ⅲ级、 患者肿瘤直径&>20 mm和≤20 mm之间有统计学差异(P&<0.05); 而在淋巴结转移阴性和阳性、 雌激素受体阴性和阳性之间均无统计学意义。(2)乳腺癌组血浆循环DNA浓度明显高于乳腺良性病变组和正常对照组， 相比较有统计学差异(P&<0.05); 而良性病变组血浆循环DNA浓度高于正常对照组， 但差异无统计学意义。(3)以血浆循环DNA≤12.90 μg/L作为诊断乳腺癌的临界值， 其检测灵敏度为85.0%， 特异度为88.3%， 准确度为87.1%。(4)Roc曲线下面积(AUC)为0.879， 95%可信区间为0.830～0.928。结论: 乳腺癌患者的血浆DNA水平与疾病的发生、 发展和预后密切相关， 血浆DNA水平有助于乳腺癌的鉴别诊断。
【关键词】 乳腺肿瘤; 血浆; 循环DNA
随着近年来肿瘤细胞生物学及分子生物学的深入研究， 以及分子生物学检测技术的快速发展， 外周血肿瘤标记由于检测的方便和非侵入性， 己逐步替代了受到标本采集以及无法连续监测和随访追踪等诸多限制的组织学肿瘤标记。而外周血循环DNA及其改变的分子生物学检测正以其不可替代的优点逐渐被人们所重视， 并成为肿瘤细胞生物学及分子生物学研究中引人注目的一个亮点[1]。近年来， 日益增多的研究表明， 肿瘤在生长过程中能持续释放肿瘤细胞DNA进入外周血液， 健康人体的血清及血浆中只含有极少量的循环DNA， 在炎症及肿瘤患者外周血中循环DNA的浓度增加， 伴有转移的肿瘤患者其浓度更高于早期患者[2]。目前研究显示多种恶性肿瘤患者的血浆循环DNA含量增加， 而且这些DNA具有与肿瘤组织中DNA相同的基因特性[3]。因此， 我们对乳腺癌患者血浆循环DNA水平进行研究， 为血浆循环DNA在乳腺癌的诊治中的作用提供理论依据。
1 资料和方法
1.1 一般资料 2007-09/2008-06本院收治的乳腺癌患者80例， 均有详细病理资料。年龄3～74(平均56.16±8.38)岁; 组织学分级Ⅰ级37例， Ⅱ～Ⅲ 43例; 肿块≤20 mm者45例， 肿块&>20 mm者33例; 淋巴结阴性患者37例; 淋巴结阳性者43例; 雌激素受体( ER )阳性者36例， ER阴性者44例。并选择年龄匹配的40例乳腺良性病变患者和97例健康自愿者作为对照组。
1.2 方法
1.2.1 样本收集 所有乳腺癌患者在接受治疗前， 采集患者晨起空腹， 抽取5 mL静脉血， 置于盛有促凝剂试管中， 放置4℃冰箱保存并在6 h内处理。用低温离心机4℃ 3 000 r/min离心15 min后， 用无菌的Eperdoff管吸取15 μL在高倍显微镜下观察无细胞及细胞碎片残留为合格标本， 放入1.5 mL无菌EP管中放-80度的低温冰箱保存备DNA抽提。相同方法采集保存乳腺良性病变、 健康自愿者的血液样本。
1.2.2 血浆DNA的提取和纯化 用微量基因组DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit， Qiagen)提取血浆DNA。方法按试剂盒中说明进行， 取200 μL血浆加入20 μL蛋白酶和200 μL裂解液， 充分混匀后， 56℃温浴10 min， 加250 μL无水乙醇， 柱离心法纯化回收DNA， 用80 μL buffer AE洗脱。
1.2.3 血浆DNA定量 取20 μL纯化的血浆DNA， 与180 μL含荧光染料的工作液(QuantiTTM dsDNA HS试剂盒提供)混匀， 取10 μL该试剂盒提供的标准品与190 μL工作液混匀， 室温放置2 min， 用QubitTM荧光仪测定标准品及样品， 根据标准曲线换算出样品中的DNA含量。
1.2.4 统计学分析 所有计量资料采用x±s表示， 统计处理先用F检验， 再行q检验。配对资料采用配对t检验。数据分析采用SPSS13.0统计分析软件， P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 乳腺癌临床病理学各参数之间血浆循环DNA含量的比较 血浆循环DNA含量在组织学分级Ⅰ级和Ⅱ～Ⅲ级、 患者肿瘤直径&>20 mm和≤20 mm之间有统计学差异(P&<0.05); 而在淋巴结转移阴性和阳性、 雌激素受体阴性和阳性之间均无统计学意义(表1)。
2.2 三组血浆循环DNA水平的检测 乳腺癌组血浆循环DNA水平显著高于乳腺良性病变组和正常对照组， 相比较有统计学差异(P&<0.05); 而良性病变组血浆循环DNA水平高于正常对照组， 但差异无统计学意义(表2)。
2.3 血浆循环DNA诊断性试验的敏感性与特异性分析 80例乳腺癌患者血浆循环NDA测定结果， 结合137例对照(97例正常对照组和40例良性病变组)数据， 取不同临界值， 计算其相应的灵敏度和特异度。结果提示， 以血浆循环DNA≤12.90 μg/L作为诊断乳腺癌的临界值， 其检测灵敏度为85.0%， 特异度为88.3%， 准确度为87.1%， 诊断效果最好(表3)。表1 乳腺癌临床病理学各参数之间血浆循环DNA含量的比较表2 三组血浆循环DNA浓度比较表3 不同临界值血浆循环DNA诊断乳腺癌的灵敏度和特异度
2.4 受试者工作特征曲线(ROC曲线) 用真阳性率和假阳性率作图所得曲线， 它可表示灵敏度和特异度之间的相互关系， 曲线上的每一点代表了随着病例诊断阈值或置信阈变化的灵敏度与特异度。Roc曲线下面积(AUC)可反映诊断试验的准确性大小， 计算图1的AUC为0.879， 95%可信区间为0.830～0.928， 表明血浆循环DNA定量分析对乳腺癌具有较好的诊断价值。
3 讨论
有关乳腺癌血浆循环DNA含量与传统的临床病理学预后因素的研究仍然不能明确这一指标是否具有独立预测预后的价值， 因此， 众多学者把循环DNA含量作为辅助因素与临床病理学参数结合起来分析。研究认为组织学分级与DNA的含量有关[4]， 我们实验结果表明乳腺癌Ⅱ～Ⅲ级血浆循环DNA含量显著高于Ⅰ级(P&<0.05)， 随着循环DNA含量增高， 肿瘤的分化程度越差， 组织学分级越高。本研究结果显示， 肿瘤直径&>20 mm的血浆循环DNA含量明显高于≤20 mm(P&<0.05)， 由于肿瘤大小反映了肿瘤的年龄， 表明循环DNA含量在乳腺肿瘤形成的早期浓度较低。因此， 循环DNA的检测不仅可以为组织学分级提供客观依据， 同时作为1项与组织学分级相关的预后指标， 循环DNA含量的检测具有更高的敏感性[5]。
健康人体的血清及血浆中只含有极少量的循环DNA， 在炎症及肿瘤病人中外周血循环NDA的浓度增加[6]。本研究中乳腺癌患者血浆循环DNA水平显著高于乳腺良性病变及健康对照组， 而乳腺良性疾病的血浆循环DNA水平与健康对照组间无统计学差异， 提示良性病变虽然存在细胞增生， 但对血中循环DNA影响并不明显。乳腺癌血浆循环DNA作为诊断性试验的敏感性与特异性分析表明， 以血浆循环DNA浓度≤12.90 μg/L作为诊断乳腺癌的临界值， 其检测灵敏度为85.0%， 特异度为88.3%， 准确度为87.1%。ROC曲线分析结果显示， 高血浆循环DNA水平与乳腺癌变间具有较强的关联， 提示血浆循环DNA检测对于乳腺癌诊断具有较高价值。
不论是临床病理学指标还是循环DNA含量均可反映乳腺癌的生物学特征， 在预测乳腺癌预后方面均具有各自不同的优点， 但仅仅选用1种预后指标却无法揭示出肿瘤的本质特征。但血浆循环DNA检测方法与病理学手段相比， 血浆是一种易得的标本， 且无创伤性， 诊断价值高。因此， 通过血浆循环DNA检测诊断乳腺癌具有一定的优越性， 值得临床应用。
参考文献
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