作者：袁江永， 谢小娟 李英， 王丽梅
【摘要】 目的: 探讨非诺贝特对糖尿病大鼠肾组织MCP1、 FN表达的影响。方法: 选择健康雄性SD大鼠36只， 随机分为正常对照组(NC组)、 糖尿病模型组(DN组)和非诺贝特治疗组(DF组)， 每组12只， 模型组及治疗组以链脲佐菌素诱发糖尿病， 治疗组给予非诺贝特灌胃。分别于第4、 8周观察各组大鼠脂代谢、 血肌酐及24 h尿蛋白定量。肾组织标本行免疫组化检测肾组织MCP1、 FN的表达水平。结果: 模型组胆固醇、 甘油三酯、 肌酐及24 h尿蛋白定量水平的表达水平较同期正常组(P&<0.01)和治疗组(P&<0.05)有明显的增加。模型组大鼠肾组织MCP1、 FN表达较同期正常组(P&<0.001)和治疗组(P&<0.01)有明显的增加。结论: 非诺贝特可以下调糖尿病大鼠肾组织MCP1、 FN表达对试验性糖尿病大鼠具有部分肾保护作用。
【关键词】 非诺贝特; 糖尿病肾病; 单核巨噬细胞趋化蛋白1; 纤维连接蛋白
糖尿病肾病(diabetic nephropathy， DN)是糖尿病最严重的并发症之一， 是 DM致死、 致残的主要原因。近来的研究表明单核巨噬细胞趋化蛋白1(monocyt chemoattractant protein1， MCP1)在糖尿病肾病肾组织表达增加， 以炎症形式促进DN进展。非诺贝特广泛用于动脉粥样硬化、 糖尿病等疾病的降脂治疗， 近来动物实验研究发现非诺贝特可以抑制糖尿病大鼠的TGFβ1而对糖尿病大鼠有部分肾保护作用。本实验我们以SD大鼠建立糖尿病大鼠模型， 用非诺贝特治疗， 免疫组化测定MCP1及FN的表达， 研究非诺贝特肾保护的机制及其与MCP1和FN的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 体质量180～200 g的雄性SD大鼠36只(购于河北医科大学实验动物中心合格证编号: DK04020098)。链脲佐菌素(STZ)(sigma公司， 批号040103); MCP1、 FN抗体、 第二抗体生物素标记的兔抗大鼠抗体(武汉博士德公司)。非诺贝特胶囊(法国利博福尼公司， 批号h30040004)。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立、 分组 动物随机分为正常对照组(NC组)、 糖尿病组(DN组)、 非诺贝特治疗组(DF组)， 每组12只。DN组及DF组大鼠腹腔注射STZ60 mg/kg， 72 h后测尾静脉血糖≥16.7 mmol/L， 尿糖3﹢～4﹢， 确定为糖尿病大鼠。
1.2.2 给药取材 次日， DF组给予非诺贝特40 mg/(kg·d)灌胃， DN组、 NC组只给等量自来水灌胃， 试验期间， 所有大鼠自由进食水， 不给胰岛素及其它降糖药物治疗。于灌胃4周和8周末， 各组随机选取大鼠6只， 宰杀前1 d置代谢笼， 收集24 h尿， 测尿量并离心， 待测尿蛋白; 先称重， 然后断头取血， 分离血清， 待测血生化; 取肾组织用100 mL/L甲醛溶液固定， 待测免疫组化检查。
1.2.3 生化指标测定 采用Beckmen全自动生化分析仪测定血糖、 血甘油三酯、 胆固醇、 血肌酐、 尿蛋白， 并计算24 h尿蛋白定量， 结果用体质量矫正。
1.2.4 免疫组化染色 组织标本经甲醛固定， 石蜡切片脱蜡至水， 孵育后胰蛋白酶封闭， 加入第一抗体(MCP1、 FN抗体)第二抗体， 再加辣根过氧化物酶标记卵白素复合物， 孵育显色， 树脂封片， 最后用高清晰彩色病理图像免疫测量系统(HPLAS1000)进行分析。MCP1测定: 每张切片随机选取 5个肾小球， 计算每个肾小球内抗体染色阳性细胞数， 以均值表示每例肾小球横切面(glomerulum crosssection， GCS)中阳性细胞数， 计算每张切片皮质区 50个高倍视野下阳性小管数与总肾小管数的百分数， 以均值表示每例肾小管中的阳性率。FN的测定: 每个标本按次序选5个视野， 做灰度扫描， 测定每个视野细胞外基质着色面积， 取其平均值。
1.2.5 统计学分析 数据以x±s表示， 所有数据用SPSS13.0统计软件处理， 组间比较用方差分析和q检验。
2 结果
2.1 一般状况 DN组及DF组在注射STZ后第4～5日即出现多饮、 多尿、 多食， ， 逐渐消瘦， 垫料潮湿甚至成稀泥状， 须每日更换垫料， 而NC组大鼠饮食正常， 体质量增加， 毛色有光泽。
2.2 生化测定的比较 DN组及DF组的血胆固醇、 甘油三酯血肌酐及24 h尿蛋白定量均高于NC组(P&<0.01)， DF组低于DN组(P&<0.05， 表1)。
2.3 免疫组化肾组织MCP1、 FN的比较 DN组大鼠在第4周及第8周MCP1FN的表达均较NC组高(P&<0.01)， 治疗后的DF组大鼠MCP1、 FN的表达较DN组有明显的下降(P&<0.05)， 但较NC组仍高(表2)。表1 鼠血TC、 TG、 Scr及24 h尿蛋白定量表2 大鼠肾组织MCP1与FN的表
3 讨论
MCP1作为一个重要的趋化因子， 是趋化性细胞因子CC亚家族的一个成员， 是一条由76个氨基酸残基构成的蛋白单链。正常肾组织中多种细胞如肾系膜细胞、 小管上皮细胞、 肾小球内皮细胞等都可分泌微量的MCP1。与本研究结果一致， 说明微量的表达是正常肾脏生理功能所必须。MCP1的主要功能是趋化和激活单核细胞至炎症部位。它与单核细胞上MCP1受体CCR2高亲和力特异性结合， 通过钙离子依赖的PKC介导的信号途径发挥生物学作用。
近来研究证明在糖尿肾病的发生发展过程中有炎症的因素[1]参与。MCP1可以促使炎性细胞如单核巨噬细胞在糖尿病肾病肾组织的聚集， 浸润， 促使细胞外基质堆积、 基底膜增厚和肾小球硬化。本研究显示糖尿病大鼠肾组织MCP1的表达较正常组有明显的上调。Sassy Prigent等[2]发现糖尿病鼠肾小球血管细胞MCP1mRNA表达的升高。Wada等[3]在糖尿病伴肾病综合征患者毛细肾小管， 肾毛细血管内皮细胞以及间质浸润的单核细胞中检测到MCP1阳性细胞。结合本文研究认为在糖尿病患者体内， 多元醇代谢通路的激活， 严重的糖激化， 氧化应激产物的形成， NFκB、 蛋白激酶C的活化， 以及血管活性激素如AngⅡ、 AngⅢ都可刺激肾脏固有细胞表达MCP1， 使间质浸润细胞产生MCP1。而MCP1趋化单核巨噬细胞， 激活黏附分子， 诱导溶酶体的释放， 活化TGFβ1， 促进超氧阴离子和胶原的产生， 其中FN的表达增加， 导致DN的进展。
经非诺贝特治疗后， 肾组织MCP1及FN表达下调， 糖尿病大鼠尿蛋白定量、 血肌酐有明显的下降。已有研究证实非诺贝特[5]可以降低糖尿病大鼠肾组织TGFβ1， TGFβ1能促进基底细胞分泌和表达MCP1[4]。TGFβ1的下调有可能使MCP1及FN表达下调。高胆固醇水平刺激肾小球MCP1的表达， 促进单核/巨噬细胞在肾小球的浸润[6]。本研究中糖尿病肾病大鼠胆固醇升高， 肾组织MCP1的表达增加， 与文献一致。曾有研究认为[7]非诺贝特可以解除炎症因子抑制的肾小球系膜细胞的胆固醇的排出。可认为非诺贝特可以解除炎症因子对细胞内胆固醇的排出的抑制， 减少脂质在肾小球的沉积从而下调MCP1的表达， FN表达也下调， 减轻肾小球的硬化。总之， 非诺贝特可以下调MCP1及FN的表达， 对糖尿病肾病具有部分肾保护作用
参考文献
[1] 马洪波， 张木勋， 路 群， 等. 糖尿病大鼠肾组织中核因子κB调控单核细胞趋化蛋白1表达作用的研究[J]. 中华糖尿病杂志2004， 12(2): 136-138.
[2] Sassy Prigent C， Heudes D， Mandet C， et al. Early glomerular macrophage recruitment in streptozotocininduced diabetic rats[J]. Diabetes， 2000， 49(3): 466-475.
[3] Wada T， Furuichi K， Sakai N， et al. Upregulation of monocyte chemoattractant protein1 in tubulointerstitial lesions of human diabetic nephropathy[J]. Kidney Int， 2000， 58(4)1492-1499.
[4] 包 艳， 李 敬， 甘佩珍. 单核细胞趋化蛋白1与转化生长因子β1 在糖尿病肾病中的关系[J]. 实用医学杂志， 2004， 20(6): 635-637.
[5] 李 英 ， 王淑欣， 王茹仙. 非诺贝特对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用的研究[J]. 中国病理生理杂志， 2002， 18(12): 342-344.
[6] Kodama N， Otani H， Yamada Y， et al. Involvement of MCP1 and MCSF in glomerular foam cell formation in ExHC rats[J]. Kidney Int Suppl， 1999， 71(5): 174-177.
[7] Ruan XZ， Moorhead JF， Fernando R， et al. PPAR agonists protect mesangial cells from interleukin 1βinduced intracellular lipid accumulation by activating the ABCA1 cholesterol efflux pathway[J]. J Am Soc Nephrol， 2003， 14(3): 593-600.ISSN1007-8738