异氟醚麻醉对脑内ERK1/2和PKCγ磷酸化水平的影响

【摘要】 目的: 探讨异氟醚麻醉对脑内ERK1/2和PKCγ磷酸化水平的影响。方法: 采用雄性BALB/c小鼠， 随机分为5组， 即对照组(Con): 未麻醉; 异氟醚麻醉5 min组(Iso1); 异氟醚麻醉1 h组(Iso2); 麻醉1 h后停药2 min组(E1): 异氟醚麻醉1 h后， 小鼠脱离麻醉环境2 min; 麻醉1 h后停药1 h组(E2): 异氟醚麻醉1 h后， 小鼠脱离麻醉环境1 h。用异氟醚进行麻醉后进行Western blot。以βActin为内参， pERK A/Actin A为ERK表达水平指标， pPKCγ A/Actin A为pPKCγ表达水平指标。结果: 在Con组， pERK1/2和pPKCγ呈现高表达状态， 给予异氟醚麻醉处理组(Iso1和Iso2组)， pERK1/2和pPKCγ表达减弱(P&<0.05)， 当异氟醚麻醉停止后(E1和E2组)， pERK1/2和pPKCγ表达逐渐恢复， 与Con组相比无统计学差异， 与异氟醚处理组相比， 有统计学差异(P&<0.05)。结论: 异氟醚麻醉-苏醒过程中， 脑中部分核团pERK1/2和pPKCγ水平发生显著变化。

【关键词】 异氟醚; ERK1/2; PKCγ

异氟醚合成于1965年， 由于它具有诱导快、 循环稳定、 肌松良好及副作用少等优点， 异氟醚已成为目前临床上应用最为广泛的一种挥发性麻醉药[1]， 但异氟醚全麻作用的分子机制仍不十分清楚。MAPK信号传导系统是一重要的细胞信号传递方式， 影响着细胞的增殖、 分化等多种生物学过程， 并与其他的信号传递系统间存在着复杂的联系。因此， 我们通过脑内ERK1/2和PKCγ磷酸化水平对异氟醚麻醉的分子机制进行了研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性BALB/c小鼠60只， 8周龄， 体质量18～22 g， 由河南康达实验动物有限公司提供。动物购回后在新环境中先适应1周， 以减少或去除新奇环境应激对实验结果的可能影响。1周后将动物随机分为5组(每组n=12): (1)对照组(Con): 未麻醉; (2)异氟醚麻醉5 min组(Iso1); (3)异氟醚麻醉1 h组(Iso2); (4)麻醉1 h后停药2 min组(E1): 异氟醚麻醉1 h后， 小鼠脱离麻醉环境2 min; (5)麻醉1 h后停药1 h组(E2): 异氟醚麻醉1 h后， 小鼠脱离麻醉环境1 h。

　　1.2 方法 (1)动物麻醉: 将各处理组小鼠置于透明的不完全封闭的麻醉箱中进行麻醉， 对照组吸入1 000 mL/L纯氧5 min后直接脱臼处死; 用麻醉机向麻醉箱中通入异氟醚， 待小鼠翻正反射消失后， 维持异氟醚于1MAC(minimum alveolar concentration)5 min(Iso1组)或1 h(Iso 2、 E1和E2组)。(2)Western blot: 各组小鼠(每组6只)处理结束后迅速脱臼处死， 断头后立即打开颅腔， 仔细取出鼠脑， 用洗涤液漂洗后， 置于冰上， 取出感觉皮质， 称质量后以1∶5的比例加入RIPA， 置于冰槽中研磨20 min， 使组织完全被裂解后， 吸出组织匀浆， 用低温离心机4℃ 12 000 r/min离心10 min。吸取上清， 用BCA试剂法测定蛋白浓度。加入loading buffer后， 100℃煮沸10 min， 分装后存于-20℃冰箱待用。样本从冰箱中取出后， 离心5 min， 按照蛋白定量得到的浓度加不同体积的样品， 使得每个加样孔的上样量基本为50 μg， 进行100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白质由SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至NC膜， 用10 g/L BSA室温封闭膜1 h。pERK1/2多克隆抗体(或pPKCγ)和βActin用抗体稀释液稀释， 将膜分别置于这两种一抗中室温孵育2 h。TBST清洗， 5 min×3次， 二抗室温孵育1 h。二抗为生物素化的羊抗兔IgG， 用抗体稀释液稀释。TBS清洗， 5 min×3次。生物素卵白素辣根过氧化物酶复合物室温孵育1 h。TBS清洗， 5 min×3次。硫酸镍胺加强DAB蓝色反应法呈色。待有清晰蓝色目的条带出现时， 终止反应。将条带用计算机成像系统采像， 用ImagePro Plus 6.0分析软件测量各组条带的光密度值(A值)。

　　1.3 评价指标 以动物翻正反射消失和翻正反射恢复作为判断麻醉产生和动物清醒的指标; 以βActin为内参， pERK A/Actin A为ERK表达水平指标， pPKCγ A/Actin A为pPKCγ表达水平指标。

　　1.4 统计学分析 实验数据采用软件SPSS 12.0软件进行统计学处理和分析， 计量资料以x±s表示， 各组间整体差别采用单因素方差分析， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 各组小鼠脑内皮质pERK1/2表达情况比较 在Con组， pERK1/2呈现高表达状态， 给予异氟醚麻醉处理组(Iso1和Iso2组)， pERK1/2表达减弱(P&<0.05)， 当异氟醚麻醉停止后(E1和E2组)， pERK1/2表达逐渐恢复， 与Con组相比无统计学差异， 与异氟醚处理组相比， 有统计学差异(P&<0.05， 图1)。

　　2.2 各组小鼠脑内皮质pPKCγ表达情况的比较 在Con组， pPKCγ呈现高表达状态， 给予异氟醚麻醉处理组(Iso1和Iso2组)， pPKCγ表达减弱(P&<0.05)， 当异氟醚麻醉停止后(E1和E2组)， pPKCγ表达逐渐恢复， 与Con组相比无统计学意义， 与异氟醚处理组相比， 有统计学差异(P&<0.05， 图2)。

　　3 讨论

　　ERK (extracelluar signalregulated kinase) 是一类丝/苏氨酸蛋白激酶， 是传递丝裂原信号的信号转导蛋白。ERK涉及到调节细胞的多种生理功能， 在多种疾病的发病机制和病理生理过程中以及行为反应和认知方面如学习、 记忆等都起着关键的作用[2]。脑组织内ERK1/2蛋白激酶磷酸化参与调节突触可塑性、 长时程增强进而影响记忆的形成[3， 4]。Selcher等[5]报道在小鼠海马内注射PD98095， 或者通过全身给药的方式给予可以通过血脑屏障的强效ERK活化阻断剂SL327， 导致了动物记忆能力的削弱。已有研究ERK通路可能参与麻醉效应的产生。异氟醚在血管平滑肌细胞通过PKC和CaMKII的活化可激活ERK1/2通路[6]。Springell等[7]对大鼠延髓外侧区进行研究发现: 当给予氟烷或戊巴比妥钠麻醉时， 该区域神经细胞pERK表达增强。蛋白激酶C(PKC)是二脂酰甘油(DAG)赖以发挥第二信使效应的主要靶酶。许多研究己经关注PKC在调节麻醉效应中的作用。并已证实PKC是目前发现的对全麻药物敏感的信号转导靶位。全麻药物对其活性的影响与其油/水分配系数有着良好的相关性。许多研究支持麻醉剂刺激PKC在完整细胞内的活化。

　　本实验中， 我们系统地观察异氟醚麻醉苏醒过程中的各个阶段pERK1/2和pPKCγ在脑内的表达变化， 设立了不同时间点进行比较: Iso1组的设立是为了观察麻醉起效初期(5 min)小鼠脑内pERK1/2和pPKCγ的表达， 以通过和对照组(Con)的比较， 了解可能与麻醉起效有关的核团; Iso2组是观察在麻醉稳定状态下(1 h)脑内pERK1/2和pPKCγ的表达情况; E1组的设计是为了观察小鼠异氟醚麻醉结束后翻正反射刚刚恢复， 即由麻醉转变为苏醒的临界状态时脑内核团的变化， 这时的变化可能与麻醉苏醒的机制相关。而在E2组， 小鼠经历了1 h的异氟醚洗脱期， 已完全从麻醉状态恢复过来， 此时， 脑内核团的pERK1/2和pPKCγ表达状况可以用作苏醒期的代表， 以和麻醉状态的表达相比较。总之， 我们研究发现异氟醚麻醉-苏醒过程中， 脑中部分核团pERK1/2和pPKCγ水平发生显著变化， 这些变化和麻醉机制/效应的关系， 还有待于进一步研究证实。

参考文献

　[1] 靳艳卿. 异氟醚全麻作用的分子机制[J]. 国外医学·麻醉学与复苏分册， 2000， 21(3): 174-177.

　　[2] Valjent E， Caboche J， Vanhoutte P. Mitogenactivated protein kinase/extracellular signalregulated kinase induced gene regulation in brain: a molecular substrate for learning and memory[J]. Mol Neurobiol， 2001， 23(2-3): 83-99.

　　[3] Kandel ER.The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses[J]. Science， 2001， 294(5544): 1030-1038.

　　[4] Sweatt JD. Mitogenactivated protein kinases in synaptic plasticity and memory[J]. Curr Opin Neurobiol， 2004， 14(3): 311-317.

　　[5] Selcher JC， Atkins CM， Trzaskos JM， et al. A necessity for MAP kinase activation in mammalian spatial learning[J]. Learn Mem， 1999， 6(5): 478-490.

　　[6] Zhong L， Su JY. Isoflurane activates PKC and Ca(2+) calmodulindependent protein kinase II via MAP kinase signaling in cultured vascular smooth muscle cells[J]. Anesthesiology， 2002， 96(1): 148-154.

　　[7] Springell DA， Costin NS， Pilowsky PM， et al. Hypotension and shortterm anaesthesia induce ERK1/2 phosphorylation in autonomic nuclei of the brainstem[J]. Eur J Neurosci， 2005， 22(9): 2257-2270.ISSN1007-8738