旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原保护性免疫的比较研究

　　　　作者：毛立群， 唐洁， 杨静， 李覃， 牛秀珑， 叶路， 孙奕

【摘要】 　　目的: 比较旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原诱导小鼠产生保护性免疫效果的异同。方法: 制备旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原， 分组免疫小鼠， 并于末次免疫后10 d用旋毛虫感染性幼虫对各组小鼠实施攻击感染， 检测攻击感染后各组小鼠肠道成虫和肌肉幼虫数并计算减虫率， 同时采用ELISA法检测各组小鼠血清IgG抗体水平。结果: 成虫抗原免疫组小鼠和肌幼虫抗原免疫组小鼠检获的肠道成虫数和肌幼虫数均显著少于对照组（P＜0.05)， 其中以成虫抗原免疫组小鼠减虫率最高（P＜0.01）。成虫抗原免疫组和肌幼虫抗原免疫组小鼠于实施旋毛虫感染性幼虫进行攻击感染的当日所检测的血清IgG抗体水平与其免疫前相比均升高（P＜0.01， P＜0.05)， 与对照组相比亦升高（P＜0.01， P＜0.05)， 其中也以成虫抗原免疫组小鼠血清IgG抗体升高最为显著（P＜0.01）。结论: 旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原均能激发小鼠产生保护性免疫， 其中成虫抗原免疫组小鼠显示出更好的抗感染保护性。

【关键词】 旋毛虫; 成虫抗原; 肌幼虫抗原; 保护性免疫

　　［Abstract］AIM: To compare the immune protective effects of the mice immunized by antigens derived from adult worms and muscle larvae of Trichinella spiralis. METHODS: The adult worm and muscle larvae antigens of Trichinella spiralis were prepared and two groups of mice (adult worm antigen group and muscle larvae antigen group) were immunized with them， respectively. After 10 days of the final vaccination， the mice in each group were challenged with infective larvae of Trichinella spiralis. The number of intestinal adult worms and muscle larvae were examined and their reduction rate was calculated. Meanwhile， the level of serum IgG in each group was detected by ELISA. RESULTS: Compared with control group， the number of intestinal adult worms and muscle larvae in adult worm group and muscle larvae antigen group was lower（P＜0.05) and number of intestinal adult worms and muscle larvae in adult worm antigen group was at the lowest（P＜0.01). When the mice in the two groups were challenged with infective larvae of Trichinella spiralis， the titer of serum IgG detected on the same day was higher than that before they were vaccinated with the antigens（P＜0.01， P＜0.05) and it was also higher than that in control group（P＜0.01， P＜0.05). The level of serum IgG of the mice detected on the day when they were challenged with infective larvae of Trichinella spiralis was significantly higher than that before the mice were vaccinated and it was also higher than that in adult worm antigen group（P＜0.01）. CONCLUSION: Both the adult worm and muscle larvae antigens of Trichinella spiralis can stimulate mice to produce protective immunity and the mice immunized with adult worm antigens have stronger resistance to the subsequent challenge infection.

　　［Keywords］trichinella spiralis; adult worm antigen; muscle larvae antigen; protective immunity

　　旋毛虫病是一种人畜共患病， 对人类及畜牧业危害严重。旋毛虫抗原成分复杂， 各种抗原诱导产生的保护性免疫效果也各有不同［1］， 给旋毛虫病的预防工作带来很大困难。我们应用旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原分别免疫小鼠， 再采用相同数量的感染性幼虫对其进行攻击感染， 通过检测减虫率及小鼠血清IgG水平来评价旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原免疫后小鼠所获得的抗感染能力， 以研究旋毛虫不同发育时期的抗原所诱导产生的保护性免疫效果， 为进一步研究旋毛虫的人工预防提供实验数据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　昆明种小鼠购自武警医学院动物饲养场。旋毛虫虫种由武警医学院寄生虫学教研室提供， 为小鼠保种传代的猪源旋毛虫。

　　1.2 方法

　　1.2.1 旋毛虫抗原的制备

　　①旋毛虫成虫可溶性抗原的制备: 小鼠灌胃感染300条/只旋毛虫感染期幼虫， 7 d 后处死， 取小肠纵行剪开并剪成2～3 cm长小段， 无菌生理盐水漂洗， 加入37℃预温的无菌生理盐水， 置37℃恒温培养箱孵育4～5 h， 使成虫从肠壁钻出， 反复无菌生理盐水沉淀、 漂洗后收集纯净的成虫。将成虫研磨成匀浆， 超声粉碎仪间歇粉碎， 4℃冰箱过夜， 以10 000 r/min 4℃离心30 min， 取上清即为成虫可溶性抗原。紫外分光光度计测定蛋白含量， -20℃冻存， 备用。②旋毛虫肌幼虫抗原的制备: 小鼠罐胃感染300条/只旋毛虫感染期幼虫， 40 d 后处死， 取全部肌肉剪碎， 加入胃蛋白酶消化液， 置37℃温箱8～12 h， 待肌肉被完全消化后， 铜网过滤， 自然沉淀， 再用生理盐水漂洗3次， 收集脱囊肌幼虫。将肌幼虫中加入无菌生理盐水， 用人工玻璃匀浆器研磨成匀浆， 超声波粉碎仪粉碎3次， 每次10 min， 置4℃冰箱过夜， 以10 000 r/min 4℃离心30 min， 收集上清即为肌幼虫可溶性抗原。紫外分光光度计测定蛋白含量， -20 ℃冻存， 备用。

　　1.2.2 小鼠的免疫接种和攻击感染

　　小鼠80只， 1月龄， 体质量18～22 g， 每组20只， 随机分为4组， 即成虫抗原免疫组、 肌幼虫抗原免疫组、 佐剂组和正常对照组。成虫抗原免疫组小鼠用含蛋白100 μg的成虫抗原0.1 mL与等体积的弗氏完全佐剂（FCA）乳化， 腹腔注射; 肌幼虫抗原免疫组小鼠用含蛋白100 μg的肌幼虫抗原0.1 mL与等体积的FCA乳化， 腹腔注射; 佐剂组小鼠用0.1 mL FCA与等体积生理盐水乳化， 腹腔注射。每隔10 d 注射1次， 共3次。正常组小鼠不做任何处理。于末次免疫注射后10 d， 用300条/只旋毛虫感染性幼虫实施攻击感染［2］。

　　1.2.3 小鼠肠道旋毛虫成虫的检测

　　于攻击感染后7 d 每组剖杀10只小鼠， 取小肠纵向剪开， 放入盛有生理盐水的平皿中， 置37℃温箱4 h， 使虫体逸出， 漂洗后收集成虫， 在解剖镜下计数并计算减虫率: 减虫率＝（对照组检获虫体均数－实验组检获虫体均数）/对照组检获虫体均数×100%。

　　1.2.4 小鼠旋毛虫肌肉幼虫的检测

　　于攻击感染后40 d， 将每组剩余的10只小鼠全部处死， 取全部肌肉剪碎， 加入胃蛋白酶消化液， 置于37℃温箱过夜。铜网过滤， 生理盐水漂洗沉淀后收集幼虫， 计数并计算减虫率。

　　1.2.5 小鼠血清IgG抗体的检测

　　各组小鼠分别于抗原免疫注射当日、 攻击感染当日、 攻击感染后7 d （即剖杀小鼠检测成虫时）和40 d （即剖杀小鼠检测肌幼虫时）分4次采血， 第1、 第2次采用断尾取血， 第3、 第4次采用眶裂取血， 分离血清， -20℃冻存， 备用。小鼠血清IgG抗体采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测［3］， 步骤如下: 20 mg/L的羊抗鼠IgG包被液0.1 mL/孔， 置4℃过夜; 次日用100 mL/L灭活小牛血清0.1 mL/孔封闭2 h; PBST洗涤后依次加1∶50稀释的小鼠待检血清0.1 mL/孔， 37℃孵育1 h， 洗涤后加入1∶200稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 0.1 mL/孔， 37℃孵育1 h， 洗涤后再加入底物溶液显色15 min， 100 mL/L硫酸终止反应; 采用酶标仪测定各孔A492值。每批均设阴性血清和PBS对照。

　　1.2.6 统计学分析

　　计量数据以x±s表示， 采用t检验， 百分率（%）采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 各组小鼠检获的肠道成虫数及减虫率

　　于实施攻击感染后7 d， 成虫抗原免疫组小鼠和肌幼虫抗原免疫组小鼠检获的肠道成虫数均明显少于对照组， 且差别具有统计学意义（P＜0.01， P＜0.05)。成虫抗原免疫组减虫率明显高于肌幼虫抗原免疫组， 且差别具有统计学意义（χ2＝1.218， P＜0.05）。佐剂组小鼠检获的肠道成虫数与对照组相比无统计学意义（P＞0.05， 表1）。表1 各组小鼠检获的旋毛虫成虫数及减虫率（略）

　　2.2 各组小鼠检获的肌幼虫数及减虫率

　　于实施攻击感染后40 d， 成虫抗原免疫组小鼠和肌幼虫抗原免疫组小鼠检获的肌幼虫数均明显少于对照组， 且差别具有统计学意义（P＜0.01， P＜0.05， 表2); 成虫抗原免疫组小鼠肌幼虫减虫率与肌幼虫抗原免疫组小鼠相比无统计学差异（χ2＝0.397， P＞0.05）。佐剂组小鼠检获的肌幼虫数与对照组相比无统计学意义。表2 各组小鼠检获的旋毛虫肌幼虫数及减虫率（略）

　　2.3 各组小鼠血清IgG抗体水平

　　第1次采血检测的A492值各组小鼠间无统计学差异。第2次采血检测的A492值与第1次相比， 成虫抗原免疫组小鼠和肌幼虫抗原免疫组小鼠均升高（P＜0.01， P＜0.05)， 以成虫抗原免疫组小鼠最为显著（P＜0.01)， 而佐剂组和对照组与第1次相比均无统计学意义; 第2次采血成虫抗原免疫组小鼠和肌幼虫抗原免疫组小鼠的A492值分别与对照组相比均升高（P＜0.01， P＜0.05)， 也以成虫抗原免疫组小鼠升高最为显著（P＜0.01)， 而佐剂组与对照组相比则无统计学差异。第3次采血各组小鼠的A492值与第2次相比， 只有肌幼虫抗原免疫组小鼠升高（P＜0.05)， 其余各组均无显著性变化; 此次检测的各组A492值分别与对照组相比， 成虫抗原免疫组小鼠和肌幼虫抗原免疫组小鼠有统计学差异（P＜0.01)， 而佐剂组与对照组相比无统计学差异。第4次采血各组的A492值与第3次相比， 成虫抗原免疫组小鼠和肌幼虫抗原免疫组小鼠均无统计学差异; 佐剂组和对照组的A492值均较前一次显著升高（P＜0.01); 各组间进行比较则无统计学差异（表3）。各组小鼠血清IgG抗体随时间消长变化规律见图1。表3 各组小鼠血清IgG抗体A492值（略）

　　3 讨论
　　
　　有研究认为， 旋毛虫体内杆细胞的颗粒分泌物是其功能性抗原的重要来源［4］。但旋毛虫抗原成分复杂， 在不同发育阶段， 其杆细胞分泌的抗原性质有所改变， 这可能是导致旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原免疫效果不同的原因之一［5］。

　　本研究表明， 旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原均可诱导小鼠产生抗感染免疫， 但免疫效果有所不同， 以成虫抗原诱导机体产生的抗感染能力较强， 主要表现为成虫抗原免疫组小鼠肠道成虫减虫率高于肌幼虫抗原免疫组小鼠; 但成虫抗原免疫组小鼠的肌肉幼虫减虫率与肌幼虫抗原免疫组小鼠相比无统计学差异， 这可能是由于测定肌肉幼虫减虫率的时间是在采用感染性幼虫攻击感染之后， 此时各组小鼠体内已感染的旋毛虫病原体干扰了免疫效果所致。本研究对各组小鼠不同时期血清IgG抗体消长变化规律的研究也表明， 旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原均能刺激机体产生IgG抗体， 并以成虫抗原免疫组小鼠血清IgG水平升高最为显著， 进一步证实旋毛虫成虫抗原能诱导机体发生较强的体液免疫应答。而第3、 第4次采血时各组小鼠血清IgG水平都开始有不同程度的升高， 原因可能也与此时各组小鼠体内都已存在旋毛虫病原体感染有关。
　　
　　特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫， 具有高度特异性和免疫记忆性， 在抗感染中发挥重要作用［6， 7］。研究表明， 宿主抗旋毛虫感染的机制以体液免疫为主， 体液免疫产生的抗体通过激活补体、 调理作用及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）发挥清除旋毛虫病原体的功能， 并对机体产生保护、 防止再感染， 其中IgG或IgE类抗体的ADCC作用可能是最重要的效应机制［8］。本研究结果表明， 旋毛虫成虫抗原具有较强的免疫原性， 其良好的保护性免疫效果与其能有效诱导机体产生较高水平的IgG有关。
　　
　　本研究从宿主抵抗旋毛虫感染的保护性免疫效果及相应的免疫学机制两方面均证实， 旋毛虫成虫抗原能使机体获得良好的抗旋毛虫感染的保护性免疫， 可能是较有希望的疫苗来源。但鉴于旋毛虫抗原的复杂性， 要研制出具有完全保护性并能有效应用于人和动物的抗原或疫苗， 仍需进行大量工作。

参考文献

　　［1］DupouyCamet J， Kociecka W， Bruschi F， et al. Opinion on the diagnosis and treatment of human trichinellosis［J］. Expert Opin Pharmacother， 2002， 3(8): 1117-1130.

　　［2］邢杰， 李鹏， 阎玉文. 感染旋毛虫大鼠免疫功能的动态观察［J］. 中国寄生虫病防治杂志， 2005， 18(1): 26-27.

　　［3］Jung D， Teifke JP， Karger A， et al. Evaluation of baculovirusderived recombinant 53kDa protein of Trichinella spiralis for detection of Trichinellaspecific antibodies in domestic pigs by ELISA［J］. Parasite Res， 2007， 100(3): 429-437.

　　［4］Nagano I， Wu Z， Boonmars T， et al. Molecular cloning and characterisation of two kinds of proteins in excretorysecretory products of Trichinella pseudospiralis［J］. Int J Parasitol， 2004， 34(4): 491-500.

　　［5］Perteguer MJ， Rodríguez E， Romarís F， et al. Minor interspecies variations in the sequence of the gp53 TSL1 antigen of Trichinella define speciesspecific immunodominant epitopes［J］. Mol Immunol， 2004， 41(4): 421-433.

　　［6］Maizels RM， Yazdanbakhsh M. Immune regulation by helminth parasites: Cellular and molecular mechanisms［J］. Nat Rev Immunol， 2003， 3(9): 733-744.

　　［7］Furze RC， Selkirk ME. Comparative dynamics and phenotype of the murine immune response to Trichinella spiralis and Trichinella pseudospiralis［J］. Parasite Immunol， 2005， 27(5): 181-188.

　　［8］Romarís F， DeaAyuela MA， Bolás F， et al. Heterogeneity and immunogenicity of the Trichinella TSL1 antigen gp53［J］. Parasite Immunol，2003， 25(6): 297-305.