雷公藤内酯醇抑制小鼠EAE与其下调脾细胞INFγ表达和上调IL10的分泌有关

　　　　 作者：樊红翠， 任晓蓉， 尉杰忠， 郭敏芳， 纪宁， 孙永胜， 梁丽云， 马存根

【摘要】 　　目的: 探讨雷公藤内酯醇（triptolide， Tri）治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的有效性和可能机制。方法: 雌性C57BL/6小鼠随机分为EAE组(28只)、 Tri治疗组（20只）和佐剂组（18只）。EAE组和Tri治疗组用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白3555多肽（MOG3555）免疫建立EAE模型， 佐剂组以等量生理盐水代替。Tri治疗组于免疫后5 d开始按100 μg/(kg·d)腹腔注射Tri， EAE组和佐剂组等量的生理盐水作为对照。观察3组小鼠的发病情况以及病理变化， 免疫后18～20 d无菌分离脾淋巴细胞， 分2组， 分别为对照组（只加200 μL的细胞悬液）、 实验组（细胞悬液中加入MOG3555每孔终浓度为10 mg/L）， 并将各组细胞悬液接种于96孔板中置于37℃、 50 mL/L CO2条件下孵育48 h。用MTT法检测MOG3555刺激前后各组脾淋巴细胞的增殖情况， ELISA检测各组细胞培养上清液中细胞因子INFγ、 IL17、 IL10和IL4的水平。结果: Tri能够显著改善EAE的发病， 减轻炎性浸润， 并且可抑制MOG3555诱导的脾淋巴细胞增殖反应（P&<0.01）及INFγ的分泌（P&<0.05）， 促进IL10的分泌（P&<0.05）， 而对IL17和IL4的分泌没有显著性影响。结论: Tri可以有效抑制小鼠EAE， 这种抑制可能与其对脾细胞中INFγ表达的下调及对IL10分泌的上调作用密切相关。

【关键词】 雷公藤内酯醇; 实验性自身免疫性脑脊髓炎; 淋巴细胞增殖; INFγ; IL17; IL10

　　［Abstract］AIM: To explore the therapeutic effectivity and the possible mechanism of triptolide (Tri) on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). METHODS: All female C57BL/6 mice were randomly pided into EAE group (28)， Tri treated group (20) and adjuvant group (18). Mice in EAE and treated groups were immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 3555 (MOG3555)， adjuvant group was injected at the same time， but instead of MOG3555 with normal saline. Tri was intraperitoneally injected in the dosage of 100 μg/(kg·d) in treated group on day 5 postimmunization (p.i.)， and mice in EAE and adjuvant group injected with normal saline as control. The clinical feature and pathological changes were observed and the splenic lymphocytes were prepared on days 1820 p.i. The cell cultures were pided into the control group (only 200 μL of cell suspension) and the experimental group (cell suspension in the presence of 10 mg/L MOG3555 ). Then all of them were inoculated in 96well flatbottom plates under 37℃， 50 mL/L CO2. After 48 h， the proliferation assay was determined by MTT， and the supernatants were harvested for the detection of INFγ， IL17， IL10 and IL4 by ELISA. RESULTS: Tri treatment showed an significantly protective action on EAE. After the intervention of Tri， the levels of IL10 were increased (P&<0.05)， but the secretion of INFγ and proliferation response of splenic lymphocytes induced by MOG3555 were statistically significantly inhibited（P&<0.05 and P&<0.01， respectively）. There were no influences on the amount of IL17 and IL4 by Tri. CONCLUSION: Tri is an effective drug in suppressing murine EAE. This suppression is surposed to be related to downregulation of INFγ and upregulation of IL10 secretion in splenic lymphocytes.

　　［Keywords］triptolide; experimental autoimmune encephalomyelitis; proliferation response; interferonγ; interleukin17; interleukin10

　　多发性硬化(multiple sclerosis， MS)是主要累及中枢神经系统（central nervous system， CNS）白质的自身免疫性脱髓鞘疾病， 具体发病机制还不清楚， 因此探讨MS的免疫学机制一直是人们关注的焦点。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE）是髓鞘特异性T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病， 与MS在病理和临床表现上极为相似， 是目前国际上公认的研究MS的理想模型。EAE在整个发生发展过程中存在着Th1/Th3型细胞偏移， 并以激活的Th1型细胞占优势。细胞因子网络在效应T细胞增殖、 分化和作用过程中起着关键的作用［1］。因此， 剖析效应T细胞分泌的细胞因子特点成为理解EAE发病机制的核心问题。

　　雷公藤内酯醇(Triptolide， Tri)是一种有效的免疫抑制剂， 临床应用日趋广泛， 但其具体的作用机制尚不清楚。尤其在MS和EAE发病机制的研究中报道较少。既往我们研究发现Tri可以通过下调IL6、TNFα、MCP1、ICAM1等的表达来保护血脑屏障， 减少T淋巴细胞进入CNS， 抑制EAE［2， 3］。但对经典的Th1细胞因子INFγ和Th3细胞因子IL10、IL4 以及炎性细胞因子IL17的分泌有无影响， 尚不清楚。本实验用Tri 干预髓鞘少突胶质细胞糖蛋白3555多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 3555， MOG)诱导的EAE， 检测Tri对MOG诱导的脾淋巴细胞增殖以及分泌细胞因子的影响， 探讨Tri治疗EAE可能的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　清洁级雌性C57BL/6小鼠， 质量18～22 g， 购自中国医学科学院实验动物研究所。MOG3555多肽（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNG）由西安联美生物科技有限公司合成， 纯度HPLC&>97%; 完全弗氏佐剂（CFA）购自Sigma公司; 结核分枝杆菌H37Ra（TB）购自BD公司; 百日咳毒素（PTX）购自中国药品生物制品研究所。Tri(纯度＞98％ HPLC）购自南京皮肤病研究所。小鼠源性INFγ、IL10、IL17、IL4的ELISA检测抗体， 高糖DMEM培养液， 青霉素链霉素双抗， 胎牛血清购自Sigma公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组及EAE模型的制备

　　将C57BL/6小鼠随机分为3组， 即EAE模型组（28只）， Tri治疗组（20只）和佐剂组（CFA， 18只）。EAE模型组和Tri治疗组均按每只0.1 mL注射含TB的MOG抗原乳剂， 在脊柱背侧后半部中线两侧分四点进针皮下注入， 佐剂组以生理盐水代替MOG多肽制成乳剂同等量同样方法注入， 并将免疫当天记为免疫后第0天(p.i. 0 d)， 各组于p.i. 0 d、 p.i. 2 d分别腹腔注射PTX（800 ng/只）作为免疫增强剂。Tri治疗组于免疫后第5天开始按100 μg/（kg·d）腹腔注射Tri溶液直到处死， EAE模型组给予同等剂量生理盐水。免疫后每天观察各组小鼠行为学表现并进行神经功能评分， 评分标准采用国际通用的五分制评分法: 0分， 无任何症状; 1分， 尾部张力消失， 可见轻度笨拙; 2分， 一侧后下肢无力， 被动翻身后可恢复; 3分， 双后肢瘫痪， 被动翻身后不能恢复， 但给予刺激后可挪动; 4分， 双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪; 5分， 濒死状态/死亡。介于两者标准之间以±0.5分记。

　　1.2.2 病理学观察

　　动物于p.i.18～20 d， 无菌取完脾脏的小鼠（见下文）， 生理盐水心脏灌流， 4%多聚甲醛灌流固定， 解剖分离脑、 脊髓， OCT包埋， 冰冻切片， 行HE染色。

　　1.2.3 脾细胞的分离和制备

　　动物于p.i.1820 d， 各组取出8只小鼠， 用100 mg/L水合氯醛按5 000 mL/kg体重腹腔注射麻醉， 750 mL/L酒精皮肤消毒后， 无菌操作取脾， 剪碎， 用一次性注射器针芯研磨， 400钼尼龙滤网过滤， 置于15mL离心管， 加入已消毒预冷的PBS中， 1 200 r/min离心5 min， 弃上清， 再加入PBS， 反复吹打重悬后再次离心， PBS洗3次， 弃上清， 按2mL/管加入已消毒预冷的双蒸水， 重悬， 45s后按1 mL/管快速加入已消毒预冷的27g/L的NaCl， 裂解红细胞， 并用已消毒预冷的PBS补充体积至10 mL左右， 1200 r/min离心5 min， 弃上清， 重悬， 细胞计数， 用DMEM完全培养液（高糖DMEM， 50 mL/L CO2的胎牛血清， 100 U/mL青霉素链霉素）将各管细胞密度调整至1×109/L， 然后将其接种在96孔板中， 200 μL/孔细胞悬液， 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育。

　　1.2.4 MTT法检测脾细胞增殖

　　48h后， 收集上清液-20℃冻存。剩余细胞设对照组（只加200 μL的细胞悬液）、 实验组（细胞悬液中加入MOG35～55， 每孔终浓度为10 mg/L)， 每组设6个复孔， 每孔加入30 μL MTT溶液（5 g/L）， 继续培养4 h， 吸干液体， 每孔加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO）， 振荡溶解紫色结晶， 测定A490值。结果用刺激指数（SI）表示。SI=实验组的A490值/对照组的A490值。

　　1.2.5 细胞因子的检测

　　参照试剂盒的说明书检测培养上清液中INFγ、 IL10、 IL17、 IL4的含量。即向96孔板中分别加入50 μL的捕获抗体， 密封后4℃过夜; 次日用洗涤缓冲液洗4次， 向96孔板中分别加入70 μL封闭液， 室温封闭1 h; 洗涤液洗涤4次， 按50　　μL/孔加入待测上清液， 每板设2个空白对照孔， 各加入50μL DMEM不完全培养液， 室温下孵育2 h; 用洗涤缓冲液洗4次， 各孔加入50 μL的相应的检测抗体（生物素标记）， 室温下孵育1 h; 洗涤缓冲液洗涤3次， 加入50 μL辣根过氧化物酶标记的卵白素， 室温下孵育45 min; 用洗涤液清洗5次后， 加入50μL 酶作用底物， 室温孵育15～20 min底物显色后， 加入50μL终止液， 测定A450值。

　　1.2.6 统计学分析

　　数据用x±s来表示， 采用SPSS13.0软件对所得数据进行分析处理。组间比较用单因素方差分析， 率的比较采用χ2检验， P&<0.05具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Tri对EAE小鼠发病的影响

　　EAE组小鼠免疫当天死亡1只， 其余小鼠从p.i.10 d开始相继发病， p.i. 17d左右达到发病高峰， 平均行为学评分达（2.466±0.812）分， 体重平均下降（0.665±0.491）g， 发病率达80%， 小鼠先是表现为尾部肌张力低下， 后进展为双侧后肢瘫痪， 不能自动翻身。Tri治疗组与EAE组相比较， 发病率明显减低， 小鼠发病相对比较晚， 体重减轻的程度显著改善， 行为学评分明显改善（表1）。表1 各组小鼠的发病情况（略）

　　2.2 Tri对EAE小鼠病理学改变的影响

　　HE染色显示EAE组小鼠炎性病灶主要侵犯脊髓实质， 主要分布在脊髓腰膨大白质区， 可见有大量炎性细胞浸润， 脑实质炎性浸润相对于脊髓比较轻， Tri治疗后小鼠脑和脊髓实质中炎性细胞浸润明显减轻。佐剂组小鼠脑和脊髓未见明显异常改变(图1)。

　　2.3 Tri对MOG35～55多肽抗原刺激的脾淋巴细胞增殖的影响 MOG3555多肽免疫小鼠后第18天， MOG3555多肽抗原刺激脾淋巴细胞增殖作用明显（P&<0.01）; Tri对MOG3555多肽抗原诱导的脾淋巴细胞增殖反应具有明显的抑制作用（P&<0.01， 表2）。表2 MOG3555 多肽刺激48 h后对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（略）

　　2.4 Tri对MOG3555多肽刺激的脾淋巴细胞细胞因子分泌的影响

　　MOG3555多肽可明显刺激脾淋巴细胞INFγ、IL10的分泌， 对IL17、 IL4的分泌没有明显影响， Tri则对MOG3555多肽抗原刺激脾淋巴细胞的INFγ分泌产生显著的抑制作用， 明显促进IL10的分泌， 但对IL17、IL4的分泌没有影响（图2）。

　　3 讨论

　　EAE是CD4+T细胞介导的自身免疫性疾病， 细胞因子的生成和调节是CD4+T细胞发挥效应作用的主要机制。MOG是EAE模型中能引起髓鞘缺失的主要免疫靶点， 是能诱导T细胞反应和自身抗体生成的自身抗原， 用其诱发的EAE模型具有MS的临床病理特点。我们利用MOG多肽作为免疫原诱导EAE模型， 并用MOG3555多肽体外刺激分离脾淋巴细胞并培养， 发现在EAE发病高峰期， 脾淋巴细胞经MOG刺激后仍表现为高度的活跃性， 细胞增殖指数较佐剂组明显高， 检测细胞上清液中细胞因子结果显示INFγ显著上调， IL17分泌没有明显改变。INFγ是IL12（p40p35）诱导的Th1细胞分泌的促炎性因子， 在EAE急性期显著上调， 其在EAE发病机制中所扮演的重要角色已经有大量的文献报道［1］， 并且抑制致脑炎Th1细胞INFγ的生成对EAE有一定的缓解作用。近来研究发现在EAE中IL17与INFγ的促炎性作用极为相似， 但IL17的升高较INFγ要早［4］。IL17由IL23（p40p19）诱导生成的Th17细胞分泌， 在EAE发病前外周淋巴细胞内即有显著升高， 发病高峰期外周淋巴细胞内IL17表达不明显， 但在CNS中可以检测到高水平的IL17生成［4］。本研究显示IL17分泌没有明显改变， 一方面可能是由于发病高峰期Th0细胞分化生成的Th17细胞主要转移至CNS来发挥作用， 另一方面可能与INFγ的拮抗作用有关。新近有研究发现IL12的组成亚基p35缺失会加重EAE［5］。更有意思的是， INFγ(-/-)的EAE小鼠淋巴结细胞经MOG刺激后Th17细胞群明显增加［6］， 进一步发现IL12受体IL12Rβ2(-/-)的小鼠脾淋巴细胞培养IL17的表达显著上调［7］。因为IL23与IL12共用p40亚基， 并与IL12Rβ1受体结合来发挥作用， 因此， 我们推测INFγ在EAE中能够通过IL12/INFγ轴抑制IL23诱导的Th17的分化， 进而抑制IL17的生成。
　　
　　IL10是Th3及调节性T细胞分泌， 被认为是一种免疫负调节因子， 可以抑制Th1细胞分泌INFγ、IL2等因子， 在EAE中具有抑制免疫病理的作用［8］。Sonobe等［4］研究发现EAE发病前脾脏CD4+和CD8+T细胞IL10mRNA表达急剧减少， 但是在CNS中IL10mRNA表达逐渐升高， EAE发病高峰期脾脏CD4+T细胞和CNS中CD8+T细胞表达IL10mRNA急剧上调， 认为这些调节性T细胞是依赖IL10发挥免疫调节作用的。IL4能够诱导初始Th0向Th3分化， 并可拮抗INFγ的作用， 尽管IL4作为EAE的抑制因子， 但IL4基因敲除鼠与对照组相比有着相似的发病率和死亡率［9］， 近来研究发现IL4并非T细胞产生， 但MOG特异性CD4+细胞可能诱导细胞无害性旁路反应产生IL4， 并且与疾病的阶段和分化场所有关［10］。本研究检测上述细胞上清液中IL10、IL4的分泌， 发现EAE疾病高峰期， IL10显著上调， IL4的分泌没有明显改变， 推测EAE高峰期即存在Th1/Th3向Th3的偏移， IL10发挥着较IL4更为显著的作用， 其抗炎性作用为下一阶段疾病的暂时缓解奠定了基础。
　　
　　Tri是从雷公藤中分离出来的含环氧的二萜内酯化合物， 近年来研究表明Tri有免疫调节作用以及抗炎性作用［11］， 但其具体调节机制仍不清楚。我们利用Tri来干预治疗MOG诱导的EAE小鼠， 结果显示Tri可以明显减低EAE小鼠发病率， 改善临床症状， 减轻病灶的炎性细胞浸润。同时还进一步证实了Tri能够明显抑制MOG3555多肽抗原诱导的EAE小鼠脾淋巴细胞增殖反应以及INFγ的分泌， 提高IL10的分泌， 推测Tri可能直接抑制Th1类细胞因子的分泌， 促进Th3类细胞因子的释放， 诱导Th1/Th3向Th3方向偏移。但对于IL4、IL17的分泌没有显著性影响。这与最近的一项研究相矛盾， Wang等［11］研究发现Tri可以抑制EAE脾单个核细胞内IL17mRNA的表达， 并与抑制核因子NFκB表达有关， 这可能与实验方法以及采集标本时间不同有关。因此Tri在EAE复杂的细胞因子网络的微观调节作用及其具体的作用机制仍有待于进一步探讨和证实， 相信Tri作为中国的传统中药， 以其资源丰富、 价格低廉的优势， 有着广阔的发展前景。

　　致谢: 本实验部分内容在复旦大学附属华山医院神经病学研究所完成， 在此对肖保国教授的悉心指导表示衷心地感谢！

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