衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达

　　　　 作者：任文君， 王群义， 吕小凤， 毛泽斌， 蒋晓刚

【摘要】 　　目的: 研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）表达增加的影响因素。方法: 用Northern blot的方法显示IGFBP3基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异; PCR扩增出人类IGFBP3上游包括5′UTR区的2 kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP3启动子片段; 将各片段用Effectene Transfection Reagent试剂盒转染到年轻和衰老细胞中， 测出几组构建基因片段的启动活性， 确定可调控转录活性的区域; 通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件。结果: 与年轻的2BS细胞相比， 衰老的2BS细胞中IGFBP3基因的表达升高; 在IGFBP3启动子+59到-58序列之间存在着蛋白结合位点; 5′ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc3′是IGFBP3的增强子元件。结论: 在衰老的2BS细胞中IGFBP3基因上游-37到-8的30 bp序列存在一个新的增强子元件IEE (IGFBP3 enhancer element)， 对IGFBP3的表达起到调控作用。

【关键词】 胰岛素样生长因子结合蛋白3; IEE (IGFBP3 enhancer element); 2BS细胞

　　［Abstract］AIM: To study the influencing factors of the increased expression of the controlling insulin growth factors binding protein3（IGFBP3）in the senescent cells. METHODS: Northern blot was used to show of the differential expression of the IGFBP3 gene in the young and senescent 2BS cells; The size of 2 kb human IGFBP3 upstream sequence including the series of the 5′UTR area was amplified by PCR， and four groups of IGFBP3 promoter fragments of different lengths were obtained by enzyme digestion. The Effectene Transfection Reagent (Qiagen) kit was used to transfect the fragments into the young and senescent cells. The promoting activity of several groups of constructing gene fragments were evaluated. The area of the controlling transfection activity was determined. The enhancer element in the activity area was ascertained by superimposing the oligonucleotide gel blocking experiment. RESULTS: Compared with the young 2BS cells， the expression of the IGFBP3 gene in the senescent 2BS cells was enhanced. There was a protein binding in the fragment site from site +59 to 58 of the IGFBP3 enhancer. 5′ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc3′ was the enhancer element of IGFBP3. CONCLUSION: In the 30 bp fragment from site 37 to 8 of the IGFBP3 gene upstream， there is a new IGFBP3 enhancer element IEE， which plays a controlling role in the expression of IGFBP3.

　　［Keywords］Insulin growth factor bindin protein3; IEE (IGFBP3 enhancer element); 2BS cells

　　胰岛素样生长因子（insulin growth factors， IGFs）是人体最重要的生长因子之一， 对人体组织细胞的生长发育有广泛而重要的调节作用。不少研究结果发现胰岛素样生长因子1 ( IGFI) 对免疫系统及多种免疫细胞有正性调节作用， 如促进T、 B 淋巴细胞和粒细胞增生［1］， 调节前B细胞分化， 促进B细胞抗体生成［2］， 增强NK细胞杀伤活性等［3］。许多免疫组织细胞也表达IGFs受体， 自身分泌IGFs和产生IGFs结合蛋白（Insulinlike growth factor binding protein， IGFBP）， 因而IGFs在免疫发育和功能调节中的作用越来越受到关注。人类和动物血浆及体液中的IGFs 绝大部分以与IGFBP 结合的形式存在， 游离的部分才具有生物活性， 约占1%。IGFs 与IGFBP的结合可调节IGFs 与IGFR 的结合， 影响胰岛素样生长因子受体(IGFR)下游信号转导通路中信号强度， 从而控制IGFs 的生物活性［4］。因此， 探明IGFBPs基因表达的分子机制， 对研究IGFs的生物学作用及调节机制奠定基础。我们扩增出人类IGFBP3上游包括5′UTR区的2 kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP3启动子片段; 将各片段用Effectene Transfection Reagent(Qiagen)试剂盒转染到年轻和衰老细胞中， 测出几组构建基因片段的启动活性， 确定可调控转录活性的区域; 通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件。为今后研究该基因的表达调控机制和生物学功能打下了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）购于中国生物制品研究所; 杂交试剂ExpresshybTM hybridization solution购于Clontech公司; Taq酶， Sac II， Pmac I， Xho I， Sma I， Nhe I， Bgl II， pGEMT Easy 质粒， Core footprinting system kit均购于Promega公司; RNA提取试剂盒RNeasy total RNA kit和转染试剂盒Effectene Transfection Reagent购于Qiagen公司; ［γ32P］ ATP购于北京福瑞公司; poly(dIdC) 购于Amersham Pharmacia Biotech公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Northern blot检测

　　用RNeasy total RNA试剂盒提取总RNA。DNA片段通过random priming kit (Promega， Madison， WI) 用［α32P］dCTP进行标记。在含有2.2 mol/L甲醛的10 g/L琼脂糖胶中进行电泳， 每个样品中总RNA为30 μg。电泳完毕后转膜并紫外交联， 用ExpresshybTM hybridization solution (Clontech)进行杂交， 放射自显影。

　　1.2.2 IGFBP3 基因5′调控区片段的构建

　　用高保真Taq酶扩增出人类IGFBP3上游包括5′UTR区的2 kb的序列。上游引物是: 5′GCT AGC ACC TGG GAC CTC AAG AAT TGC ATT T3′， （5′端加入了Nhe I酶切位点）; 下游引物是: 5′AGA TCT CGG AGC AGC ACC AGC AGA GTC AG 3′， （5′端加入了Bgl II切位点）。将扩增片段转化到pGEMT Easy 质粒当中(Promega)， 并进一步转化到pGL3 Basic质粒中， 用限制性内切酶从5′端对片段进行酶切， 酶切位点分别在-1303 （Sac II）、-778（Pmac I）、-305（Xho I）、-141（Sma I）， 这样用Sac II/Nhe I、Pmac I/Nhe I、Xho I /Nhe I和Sma I/Nhe I酶切得到四组不同长短的IGFBP3启动子片段。将酶切后的质粒用T4 DNA酶进行酶切， 并用T4连接酶连接， 将连接好的几组质粒进行电泳和测序鉴定。这样我们得到了5组片段， 起始点分别是-2031、-1303、-778、-305和-141， 并且片段均包含了转录起始位点。
　　
　　另将-305的质粒用Hind III和Bgl II酶切， 酶切后的片段用核酸外切酶III/S1核酸酶处理后从新连接测序。这样就得到了另2组基因片段， 序列是-58～+59和-114～+59。

　　1.2.3 瞬时转染

　　将质粒DNA用Effectene Transfection Reagent(Qiagen)试剂盒转染到年轻和衰老细胞中， 同时一起转入0.1μg 的pRLCMV质粒作为标准校正， 空质粒pGL3作为阴性对照。转染36～48 h后加入200μL的裂解液收集， 依照Promega双荧光素酶试剂盒建立反应体系并通过pRLCMV的标准化即可测出几组构建基因片段的启动活性。

　　1.2.4 凝胶阻滞试验

　　提取年轻和老年2BS的核蛋白， 准备好野生型和突变型的寡核苷酸探针。在探针末端用T4激酶标记上［γ32p ］ATP(3 000 mci/mmol， 标记好的探针用sephadexG50纯化。建立反应体系如下: 32P标记探针(0.3 ng)、5 μg核蛋白、1 μg 的 poly(dIdC)和20 μL Binding buffer(20 mmol/L epes， pH7.9， 1.5mmol/LMgCl2， 0.2 mmol/L EDTA，1 mmol/L二硫苏糖醇， 0.1mmol/L PMSF， 75 mL/L甘油)。在室温反应30 min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 电泳后进行放射自显影。

　　1.2.5 定点突变

　　用Quikchange(stratagene)试剂盒进行定点突变， 以pGL3为模版进行突变反应， 突变后的质粒转入到XL1Blue细胞中进行筛选， 筛选出突变质粒株并测序鉴定。

　　1.2.6 Northern及RTPCR

　　用RNeasy total RNA kit(Qiagen)试剂盒提取总RNA， 用random priming(Promega)试剂盒将α32P［dCTP］标记在IGFBP3和 GAPDH cDNA片段上。用甲醛变性胶对RNA进行电泳， 随后转膜并用紫外交联仪固定。用ExpresshybTM Hybridization 杂交液 (clontech)杂交后进行放射自显影。
　　
　　用Qiagen onestep RTPCR (Qiagen)试剂盒进行扩增， IGFBP3的上游引物是5′CAG GCT ACA CCA CCA AGG GGA AG 3′， 下游引物是5′TCC CTG TCT CTC TGT CCC TCC TAC C3′。扩增的同时加入GAPDH作为内参， GAPDH的上下游引物分别为5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3′; 5′TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3′。

　　1.2.7 双重荧光素酶报告系统

　　将野生型和突变型IEE元件克隆到带有SV40启动子的pGL3质粒中， 将构建好的质粒与内参质粒pRLCMV共转染到老年和年轻细胞中， 用荧光光度计测定荧光酶活性。

　　2 结果

　　2.1 IGFBP3基因在年轻和衰老细胞中的表达差异 Northern的结果显示与年轻的2BS细胞相比， 在衰老的2BS细胞中IGFBP3基因的表达是升高的。

　　2.2 通过在衰老的成纤维细胞中对IGFBP3的5′UTR区缺失分析确定促进表达的功能区域

　　如图1所示， 转染全长IGFBP3启动子的衰老细胞中荧光素酶活性是年轻细胞的3倍。在-2031 到-778之间不同缺失片段的启动子的活性变化不大， 进一步研究发现保留起始位点到上游-305处的启动子活性提高了5倍， 从而说明-305 到+59区域是在衰老细胞中促进IGFBP3基因表达的区域。

　　进一步的做3′端嵌套缺失研究表明（图2A）缺失从+59到 -58序列的启动子的衰老细胞中荧光素酶基因的表达明显降低， 而年轻细胞几乎没有变化。此外， 缺失+59 到-192序列的启动子在衰老及年轻细胞中几乎没有活性; 这很可能是因为转录引发位点被缺失引起的。这些结果表明在从+59到 -58序列之间存在着蛋白结合位点， 这个结合蛋白要么在年轻细胞中作为抑制因子， 要么在老年细胞作为增强因子存在。

　　2.3 通过重叠寡核苷酸确定增强子元件

　　通过凝胶阻滞实验鉴定蛋白结合序列， 如图3A所示设计5条部分重叠的双链寡核苷酸序列与年轻和衰老细胞的核蛋白进行凝胶阻滞实验。序列5′UTR1、5′UTR3、5′UTR4和5′UTR5未发现阻滞带出现， 只有序列5′UTR2与衰老细胞的核蛋白反应体系中出现了明显的阻滞带， 而与年轻核蛋白进行的反应没有阻滞带出现。加入100倍特异性未标记的探针发现可竞争性的抑制阻滞带。因此在这30 bp的序列区域包含了核蛋白的结合位点， 而且是IGFBP3的增强子元件（IGFBP3 enhancer element IEE）。
　　
　　为了确定是哪种转录因子与寡核苷酸探针结合， 用MatInspector分析图3B中的结合条带的序列， 结果未发现有已知的核转录因子的结合位点及同源序列。

　　2.4 IEE突变使衰老细胞中IGFBP3启动子活性降低

　　图4A在-305的构建质粒中随机挑选IEE里的两个碱基做3组点突变， 随后将构建的-305的质粒和突变质粒分别转到年轻细胞和衰老细胞中。测定转染后表达活性， 结果如图4B， 在衰老细胞中所有3个IEE突变体的转染后表达活性均降低了3倍以上; 而在年轻细胞中， 突变质粒的转染后表达活性只有轻微的降低。如图 4C中显示对比年轻和衰老细胞可得到相同的结果。IEE的突变造成了大约60%的荧光蛋白酶活性的降低。这说明在衰老细胞中， 存在于IGFBP3的5′UTR区中的IEE是潜在的转录活化因子的结合位点， 而在年轻细胞中这个活性或水平是降低的。

　　3 讨论

　　IGFs是人体最重要的生长因子之一， 对人体组织细胞的生长发育有广泛而重要的调节作用。不少研究结果发现 IGFI 对免疫系统及多种免疫细胞有正性调节作用， 如促进T、 B淋巴细胞和粒细胞增生［1］， 调节前B 细胞分化， 促进B细胞抗体生成［2］， 增强NK细胞杀伤活性等［3］。胸腺、 淋巴结、 外周淋巴细胞均能以自分泌、 旁分泌的方式分泌IGFI， 同时又是IGFI 的靶细胞， 提示局部IGFI 对淋巴细胞成熟分化和功能维持有重要作用。在人外周血单个核细胞各亚群中均发现有IGFRI 表达， 其中在单核细胞、 自然杀伤细胞、 CD4+ T细胞上受体密度较高， 在CD8+ T细胞上受体中量表达。Kimata等［2］通过体外试验证明， IGFI 能显著增强正常人T 细胞的集落形成， 促进B 淋巴母细胞株的增生和免疫球蛋白的合成。有研究发现IGF1 可使肿瘤细胞逃避宿主免疫监视， 诱导免疫耐受等［4］， 因而IGFs在免疫发育和功能调节中的作用越来越受到关注。
　　
　　而IGFBP 对IGF作用的发挥起重要作用， IGFBPs 通过与IGFs 结合限制了游离IGFs的水平， 使它不能与其受体结合而发挥作用。6 种IGFBPs 都能与IGFs 结合形成二聚体， 但只有IGFBP3、-5 有不耐酸亚单位(acid labile subunit， ALS) 的结合位点， 能形成IGFPIGFBPPALS 三聚体［5］。循环中90%以上的IGFs 是与IGFBP3 和ALS 结合形成150 kD 的复合物。因其分子量较大， 被结合的IGFI 不易进入组织或被降解， 故能延长IGFI 在血管中的半衰期; 而IGFBP1， 2与IGFs 组成的复合物Mr较小(30 000～40 000)， 可以通过毛细血管内皮细胞， 故能促进IGFI 进入组织， 增加IGFI 的利用。当营养不良或营养摄入减少时， 血中IGFBP3 浓度下降， IGFBP1， 2浓度上升， 二者协同作用有利于IGFI 进入组织发挥其生物学活性， 但也使血中IGFI 的浓度继续下降。IGFBPs的酶解片段对IGFs 的亲和力降低， IGFBPs 的磷酸化状态和细胞内定位也会影响其对IGFs 的亲和力， 低亲和力的IGFBPs释放出游离的IGFs， 使后者与其受体结合。可见IGFBPs在调节IGFs生物活性中的作用。因此， 探明IGFBPs基因表达的分子机制， 对我们更好的研究IGFs的生物学作用及调节机制奠定基础。
　　
　　在本研究中， 我们用PCR的方法克隆了IGFBP3上游包括5′UTR区的2 kb的启动子片段。并用酶切得到4组不同长短的IGFBP3启动子片段; 将各片段转染到年轻和衰老细胞中， 测出几组构建基因片段的启动活性， 从中确定从-58到+59的117 bp区域对IGFBP3基因的表达有强烈的促进作用。随后合成了5条部分重叠的双链寡核苷酸序列通过凝胶阻滞实验确定蛋白结合的区域是在IGFBP3基因上游-37到-8的30 bp序列， 我们将这段序列命名为IEE (IGFBP3 enhancer element)。进一步通过实验显示IEE中每个碱基的突变均可以显著的降低IGFBP3启动子的活性而且这个元件是在衰老细胞中调节转录的。在转录因子的数据库中检索并未发现与它的结合序列IEE的同源序列， 这表明它是一个新的转录因子。在本试验中中， 发现了一个新的转录增强子， 它在细胞衰老过程中促进IGFBP3的表达。下一步就是要分离并鉴定这个转录因子为进一步研究IGFBP3表达的调控奠定基础。

参考文献

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　　［2］Kimata H， Yoshida A. Effect of growth hormone and insulinlike growth factorI on immunoglobulin production by and growth of human B cells［J］. J Clin Endocrino Metab， 1994， 78: 635-641.

　　［3］Kooijman R， Willems M， De Haas CJ， et al. Expression of type I insulinlike growth factor receptors on human peripheral blood mononuclear cells［J］. Endocrinology， 1992， 131: 2244-2250.

　　［4］Jones JI， Clemmons DR. Insulinlike growth factors and their binding proteins: Biological actions［J］. Endocrine Rev， 1995， 16: 118.

　　［5］Twigg SM， Kiefer MC， Zapf J， et al. A central domain binding site in insulinlike growth factor binding protein5 for the acidlabile subunit［J］. Endocrinology， 2000， 141: 454-457.