低浓度HBsAg人群HBV DNA与HBV M定量结果的关系及评价

　　　　作者：成军 孙长贵， 陈瑜， 许志良， 戴玉柱， 孙关忠， 李晓军

【摘要】 目的: 比较高、 低浓度HBsAg阳性人群乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)与乙型病毒肝炎标志物(HBV M)含量之间的差异， 揭示低浓度HBsAg人群HBV DNA与HBV M之间的特点。方法: 对264例慢性HBV感染者的HBsAg浓度(高浓度HBsAg组、 低浓度HBsAg组)及自然史(免疫耐受期、 免疫清除期、 非活动期)进行分组， 采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)和微粒子酶免疫试验(MEIA)对147例低浓度HBsA组和117例高浓度HBsAg组的血清标本进行HBV DNA和HBV M的定量测定并进行比较。结果: 低浓度HBsAg组免疫耐受期7例、 免疫清除期4例血清标本HBV DNA、 抗HBs、 HBeAg、 抗HBe之间的差异存在统计学意义(t=2.531～9.181， P&<0.01～0.05)， 非活动期136例血清标本中有94.1%(128/136)HBV DNA处于105copies/L以下， 直接法PCR、 浓缩法PCR对HBV DNA检出率分别为10.3%(14/136)、 10.3%(47/136)， 且HBV DNA与HBV M各指标之间均不存在相关性(P&>0.05); 高浓度HBsAg组免疫耐受期25例HBV DNA与HBeAg、 抗HBe存在相关性(r=0.744～0.772， tr=3.858～4.207， P&<0.01)， 免疫清除期46例和非活动期46例HBV DNA则仅与抗HBs存在负相关性(r=-0.693～-0.598， tr=-4.616～-3.936， P&<0.01～0.05)。结论: 低浓度HBsAg人群具有特殊的血清学特点， 可能与机体免疫耐受及免疫系统个体化反应有关。

【关键词】 乙型肝炎病毒标志物; 慢性HBV感染; 乙型肝炎表面抗原

　　［Abstract］ AIM: To analyze the quantitative differences between hepatitis B virus markers (HBV M) and HBV DNA in population with highlevel or lowlevel HBsAg， and to reveal the characteristics of HBV DNA and HBV M in population with lowlevel HBsAg. METHODS: A total of 264 chronic HBVinfected patients were enrolled in our study， and were pided into lowlevel HBsAg group(147 cases) and highlevel HBsAg group(117 cases) based on the HBsAg level or were pided into immune tolerance stage， immune clearance stage and nonactive stage based on the natural history. Realtime PCR and microparticle enzyme immunoassay (MEIA) were used to determine the content of HBV DNA and HBV M in serum samples of highlevel and lowlevel HBsAg patients， respectively， then the quantitative results were compared. RESULTS: There were statistically significant differences between HBV DNA and HBV M (antiHBs， HBeAg and antiHBe) of lowlevel HBsAg patients in immune tolerance stage(7 cases) and immune clearance stage(4 cases)(t=2.531-9.181， P&<0.01-0.05). HBV DNA lower than 105copies/L was found in 94.1%(128/136) of serum samples in nonactive stage， and the detection rates of direct PCR and enriching PCR were 10.3%(14/136) and 10.3%(47/136) in lowlevel HBsAg group， respectively， and there were no correlations between HBV DNA and each of HBV M(P&>0.05). In highlevel HBsAg group， HBV DNA was positively correlated with HBeAg and antiHBe in 25 cases of immune tolerance stage(r=0.744-0.772， tr=3.858-4.207， P&<0.01)， and was only negatively correlated with antiHBs in 46 cases of immune clearance stage and 46 cases of nonactive stage(r=-0.693--0.598， tr=-4.616--3.936， P&<0.01-0.05). CONCLUSION: Population with lowlevel HBsAg have specific serological characteristics， which may be correlated with organic immune tolerance and inpidualized immune responses.

　　［Keywords］hepatitis B virus marker; chronic HBV infection; HBsAg

1 材料和方法

　　1．1 标本 随机收集日常门诊、 住院患者及体检人群慢性HBV感染者低浓度HBsAg血清标本147份(低浓度HBsAg组， 以卫生部临床检验中心提供的HBsAg定值质控血清5 μg/L为标准， HBsAg含量&<5 μg/L定义为低浓度， 经ELISA筛选后Abbott Axsym免疫分析仪测定低浓度HBsAg含量&<72±6.8S/N， 且经中和试验确证， 其中HBsAg/HBeAg/抗HBc阳性4例， HBsAg/抗HBe/抗HBc阳性137例， HBsAg/抗HBc阳性6例)， 通过随访排除了HBV感染早期或恢复期HBsAg/抗HBs转换阶段出现的低浓度HBsAg标本， 并且排除HBsAg/抗HBs阳性长期共存的标本［9］， 根据自然史［7， 8］分为免疫耐受期4例、 免疫活动期7例、 非活动或低/非复制期(非活动期)136例; 采集标本前无保肝、 降酶、 免疫调节剂和抗病毒药物应用史; 另随机收集慢性HBV感染者高浓度HBsAg血清标本117份(高浓度HBsAg组， HBsAg含量&>79S/N)， 其中免疫耐受期25例、 免疫活动期46例、 非活动期46例; HBsAg/HBeAg/抗HBc阳性31例， HBsAg/抗HBe/抗HBc阳性86例; 血清标本分装置-70℃保存。

　　1．2 试剂与仪器 ABI 7000型荧光定量PCR仪(美国ABI公司); 核酸浓缩液、 HBV DNA荧光定量PCR试剂(上海申友生物工程有限公司); AXSYM自动免疫分析仪及其检测HBsAg、 抗HBs、 HBeAg、 抗HBe、 抗HBc试剂(美国Abbott公司)。

　　1．3 方法 (1)采用实时荧光PCR定量测定两组血清标本的HBV DNA， 对未检测到HBV DNA的低浓度HBsAg组及高浓度HBsAg组标本采用浓缩法: 血清500 μL+500 μL核酸浓缩液(临界对照、 阴性对照、 阳性对照与血清标本同样处理， 参比品无需处理)， 振荡混匀4℃静置5 min， 15 000 r/min离心5 min弃上清， 加入50 μL裂解缓冲液(直接法: 血清50 μL+50 μL裂解缓冲液， 以下步骤浓缩法与直接法相同)， 剧烈振荡或用枪头搅碎至无沉淀后短暂离心， 沸水浴10 min， 15 000 r/min离心5 min取上清液备用， 或置-70℃保存1个月内检测。 (2)采用MEIA定量测定两组血清标本的HBV M， 具体按试剂说明书进行操作。(3)收集两组血清标本的HBV DNA和HBV M定量结果并以HBV DNA拷贝数进行分组: 即A组HBV DNA为105copies/L以下; B组为106copies/L……以此类推， G组为1011copies/L以上。

　　统计学分析: HBV DNA以拷贝数的对数平均值表示， 未检测到HBV DNA的标本其HBV DNA对数值直接以0计算; HBsAg(S/N)、 抗HBs(IU/L)、 HBeAg(S/N)、 抗HBe(S/CO)、 抗HBc(S/CO)均以x±s表示; 均数之间的差异比较采用t检验， 两组非活动期的HBV DNA检出率比较采用χ2检验， 对HBV DNA与HBV M进行相关性分析， 所有数据均使用SPSS12.01软件完成。

2 结果

　　对低浓度HBsAg组中的免疫耐受期4份和免疫清除期7份血清标本进行HBV DNA和HBV M定量测定发现: 免疫耐受期的HBV DNA处于D和E组， 而免疫清除期的HBV DNA处于BD组， 对两者各指标的均数进行比较发现HBV DNA对数均值(t=3.708， P=0.005)、 抗HBs (t=2.531， P=0.032)、 HBeAg(t=9.181， P=0.002)、 抗HBe(t=7.943， P=0.004)之间的差异存在统计学意义， 结果见表1。表1 低浓度HBsAg组免疫耐受期和免疫清除期HBV DNA与HBV M定量结果

　　对低浓度HBsAg组非活动期136份血清标本的HBV DNA和HBV M定量测定发现: 有94.1%(128/136)的标本HBV DNA处于105copies/L以下， 且直接法PCR检测HBV DNA仅有10.3%(14/136)的检出率， 对未检测到的标本采用浓缩法PCR则可以将检出率提高到10.3%(47/136); 经相关性分析， 低浓度HBsAg组的HBV DNA与HBV M各指标之间均不存在相关性(P&>0.05)， 结果见表2。

　　对高浓度HBsAg组各分期的HBV DNA和HBV M定量测定结果: 免疫耐受期HBV DNA与HBeAg(r=0.744， tr=3.858， P=0.002)、 抗HBe(r=0.772， tr=4.207， P=0.001)存在相关性; 免疫清除期和非活动期HBV DNA则仅与抗HBs(r=-0.693～-0.598， tr=-4.616～-3.936， P&<0.01～0.05)存在负相关性， 结果见表3～5。 表2 低浓度HBsAg组非活动期HBV DNA与HBV M定量结果表3 高浓度HBsAg组免疫耐受期HBV DNA与HBV M定量结果表4 高浓度HBsAg组免疫清除期HBV DNA与HBV M定量结果表5 高浓度HBsAg组非活动期HBV DNA与HBV M定量结果

　　3 讨论

　　对2组浓度HBsAg人群共264份血清标本进行HBV DNA和HBV M定量测定显示: 低浓度HBsAg组免疫耐受期、 免疫清除期HBV DNA分别分布于108-9copies/L、 106-8copies/L， 而高浓度HBsAg组则分布于107-11copies/L、 106-11copies/L， 无论是观察的例数还是HBV DNA分布范围均存在差别; 对低浓度HBsAg组非活动期的128份血清标本进行HBV DNA和HBV M进行定量测定， 直接法和浓缩法检测HBV DNA的检出率分别为10.3%和34.6%， 与高浓度HBsAg组(直接法65.2%， 浓缩法84.8%)相比， 差异具有统计学意义(P&<0.01); 对两组的HBV DNA与HBV M相关性分析发现， 低浓度HBsAg组除了免疫耐受期和免疫清除期的HBV DNA与HBsAg定量测定均值之间具有统计学差异(P&<0.05)外， 与其他HBV M各指标之间均不存在相关性， 而高浓度HBsAg组的免疫耐受期HBV DNA与HBeAg、 抗HBe存在相关性(r=0.744～0.772， tr=3.858～4.207， P&<0.01)， 与文献报道不尽相同［5］; 免疫清除期和非活动期HBV DNA则仅与抗HBs(r=-0.693～-0.598， tr=-4.616～-3.936， P&<0.001～ 0.05)存在负相关性， 可能由于免疫清除期与非活动期相互之间经历多次转变的结果， 但低浓度HBsAg组非活动期的HBV DNA与抗HBs无相关性， 分析可能与其低剂量引起的免疫耐受、 机体在较长时期内处于耐受状态而较少向活动期发生转变有关［10］。

　　本研究对2组浓度HBsAg病例进行自然史分期时发现: 高浓度HBsAg组免疫耐受期2例、 免疫清除期7例HBV DNA低于《慢性乙型肝炎防治指南》［7］分期标准， 非活动期28例HBV DNA高于分期标准， 而低浓度HBsAg组免疫清除期5例HBV DNA低于分期标准， 非活动期8例HBV DNA则高于分期标准， 随着PCR方法灵敏度不断提高， 《指南》中对HBV DNA水平的确定值得商榷， 故建议对《指南》中“自然史”的分期标准进行修订。

　　综上所述， 慢性HBV感染者中低浓度HBsAg人群是HBV感染、 传播、 随年龄增长自然清除过程中形成的一个特殊群体， 绝大多数处于非活动期且存在免疫耐受现象(免疫复合物形成和清除能力低下， T、 B淋巴细胞完全或不完全耐受)［11］， 而高浓度HBsAg组非活动期与免疫清除期反复交替转换， 存在免疫应答过程， 不存在免疫耐受现象， 与高浓度HBsAg组免疫耐受期也有本质的区别(年龄和高剂量耐受的差别)［10］， 因此对低浓度HBsAg人群进行系统研究， 包括在自然人群中的分布、 临床特征、 血清学乙肝标志物表现模式、 血清型、 基因型、 体液及细胞免疫功能、 S基因序列乃至全基因组的分子生物学机制及流行病学特征等研究， 有助于阐明低浓度HBsAg人群免疫耐受产生的机制， 为打破免疫耐受清除慢性HBV感染、 预防HBV传播具有重要的临床和流行病学意义。

参考文献

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