一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立

　　 作者：叶海燕， 王琳， 范振平 钟彦伟 苏何玲 刘永明， 徐东平

【摘要】 目的: 建立一种高效扩增人T细胞受体（TCR）β链可变区（Vβ）基因的方法。方法: 根据TCR Vβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、 上游外引物37条， 并将内、 外上游引物各分为8个简并组。在恒定区（C区）设计下游内、 外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条。提取细胞RNA， 用PolyA介导反转录后， 采用巢式PCR扩增正常人CD8 T细胞TCR Vβ26个亚家族基因， 并用Jurkat T淋巴瘤细胞作为对照。用Teasy载体克隆RTPCR 产物， 对克隆基因进行测序。结果: 从正常人的CD8 T细胞中扩增到所有TCR Vβ亚家族基因， 克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCR Vβ8基因， 经测序验证与文献报道一致， 且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论: 建立的巢式RTPCR方法可以高效、 广谱地扩增人TCR Vβ基因， 为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。

【关键词】 CD8 T细胞; T细胞受体（TCR）; 反转录PCR; 基因克隆

　　［Abstract］ AIM: To develop an effective assay for amplifying human Tcell receptor (TCR) variable region of β chain (Vβ)encoding genes. METHODS: Based on the property of the 26 subfamilies of human TCR Vβencoding gene sequence， 34 sets of outer and 37 sets of inner sense primers were pided into 8 degenerate primer groups， and a set of outer and inner antisense primers located in conserved region β chain (Cβ) was designed for the amplification of the TCR Vβencoding genes. In addition， a sequencing primer and a sense primer for amplifying Cβencoding genes were designed. CD8 Tcell RNA was extracted and subjected to reverse transcription mediated by poly A， followed by a nested polymerase chain reaction (PCR) to amplify the 26 subfamilies of human TCR Vβencoding genes. Jurkat T lymphoma cells were used as control. Teasy vector was employed to detect DNA sequencing of the cloned target genes. RESULTS: All the subfamilies of the Vβencoding genes were obtained from CD8 T cells of a healthy donor， except the subfamily of Vβ8 ， was obtained from Jurkat cells. The results were confirmed by DNA sequencing of the cloned genes. CONCLUSION: The nested RTPCR assay can effectively amplify human TCR Vβencoding genes with broad spectrum， which is helpful for the cloning and functional study of the TCR expressed by antigenspecific cytotoxic T lymphocytes.

　　［Keywords］CD8 T cell; Tcell receptor (TCR); RTPCR; gene cloning

T细胞受体（Tcell receptor， TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子， 可分为TCRα/β和TCRγ/δ两种类型， 外周血T细胞主要为TCRα/β的T细胞， 是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。TCRβ基因由可变区（V）、 多变区(D)、 结合区（J）和恒定区（C）四部分基因片段组成。在T细胞发育过程中V区、 D区和J 区进行重排而形成具有功能的TCR编码基因， 重排的过程中VD和DJ 之间可有不同数量的核苷酸随机插入或删减的现象， 这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性， 以识别各种不同的抗原［1］。因此， 分析TCR Vβ亚家族的表达和利用情况， 对阐明肿瘤、 自身免疫性疾病以及病毒感染等疾病的致病机制十分重要［2-4］。然而由于TCR Vβ的多样性， 采用已往报道用的RTPCR方法在T细胞数量很少以及TCR表达很微量的情况下扩增TCR基因灵敏度不高或代表性不够。本研究通过优化引物设计和应用巢式RTPCR使TCR Vβ的扩增具有很高的灵敏度和广泛的代表性。PCR产物进一步做DNA克隆， 挑取单克隆菌落测序， 了解TCR Vβ链的表达和分布情况， 为进一步研究病毒感染时特异性T细胞TCR的偏性取用（bias usage）和克隆性增殖的情况提供了方法学基础。

1 材料和方法

　　1.1 材料 用于分选CD8 T细胞的外周血单个核细胞（PBMC）来自1例男性健康成年人， Jurkat 淋巴瘤细胞为本室保存， MACS（Magnetic activated cell sorter）磁珠分选CD8 T细胞的试剂与分离柱和分离器购自德国Miltenyi Biotec公司， 荧光标记的抗CD3和抗CD8抗体购自美国BDPharmingen公司， 提取细胞RNA的RNessy mini盒、 PCR产物回收和凝胶电泳产物回收试剂盒均购自德国Qiagen公司， 反转录试剂盒和pGEM Teasy 载体均购自美国Promega公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PBMC分离和CD8 T细胞分选 按照常规方法分离PBMC， CD8 T细胞的MACS磁珠分选操作方法按说明书进行。分选后的CD8 T细胞用荧光标记的抗CD3和抗CD8抗体染色、 流式细胞术（FCM）检测CD8 T细胞的纯度和数量， 用RPMI1640液调整细胞密度至 2×109/L备用。

　　1.2.2 引物 根据文献资料［5， 6］和从GenBank下载的257条人TCR Vβ基因序列进行分析， 根据Vβ各个亚家族的基因序列特点， 在相对保守的信号肽区设计出相应的25个亚家族特异性上游引物(Vβ26亚家族基因为假基因， 故不设计实验)， 因为有些TCR Vβ亚家族内部还分为几个不同的分家族， 故共设计了上游外引物34条和上游内引物37条; 在Cβ区设计下游外引物down1、 下游内引物down2、 测序引物down3各1条， 以及扩增Cβ基因的上游引物C1（表1）。引物由上海生工公司合成。表1 扩增TCR Vβ和Cβ编码基因的引物设计

　　1.2.3 RNA提取和巢式RTPCR反应 CD8 T细胞或Jurkat细胞RNA的提取按照文献［7］的方法进行。应用(oligo)dT引物反转录合成cDNA第1链， 反转录反应条件为40℃ 1 h。以cDNA为第1轮PCR反应模板， 将上游外引物分为8组简并引物分别与down1进行8个PCR反应， PCR扩增总体积为25 μL/管， 反应条件为94℃ 5 min; 94℃ 30 s， 59℃ 30 s（每个循环递减1℃）， 55℃ 30 s， 72℃ 1 min， 30个循环; 72℃ 5 min; 68℃ 5 min。第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板， 将对应的8组简并上游内引物分别与down2加入各反应管中， 反应体积为50 μL/管， 反应条件为94℃ 3 min; 94℃ 30 s， 60℃ 1 min， 72℃ 1 min， 40个循环; 72℃ 5 min; 68℃ 5 min; Jurkat细胞RNA模板扩增基因片段长度为578 bp。一些实验中， 第2轮PCR反应使用单一上游引物分管反应， 以确定各亚家族引物的扩增效率。同时扩增βactin和TCR Cβ编码基因做为质控对照。RTPCR反应扩增TCRβ链编码基因的步骤示意见图1。

　　1.2.4 DNA克隆 PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶（溴乙锭染色）中进行电泳分析， 挑取Vβ14亚家族基因的PCR产物做DNA克隆， 切取目的基因片段， 回收PCR产物， 与pGEM Teasy 载体连接。将重组质粒转入细菌JM109， 氨苄青霉素和Xgal 蓝白斑法筛选阳性菌落， 挑取15个单克隆白色菌落于10 μL h3O中 94℃加热10 min以裂解菌体后， 按第2轮PCR体系进行PCR反应， PCR经电泳鉴定后提取重组质粒进行测序， 测序引物为down3。

　　1.2.5 序列对比 根据文献报道的标准序列号， 应用Vector NTI 软件的AlignX组件以及Virusblast软件， 将本实验所测的TCRVβ编码基因序列与已知各种TCR Vβ编码基因参考序列进行比对。

2 结果

　　2.1 RTPCR扩增TCRβ链编码基因 经反转录和用8组简并上游引物和下游引物介导二轮PCR扩增后， Jurkat细胞样本只有在含Vβ8亚家族引物的4B组扩增到了目的条带， 测序结果与文献报导一致， 为Vβ8; CD8 T细胞在分选后纯度为95.9%， 样本在8组中均扩增出目的条带（图2B）; 用各种单一引物进行第2轮PCR反应时所有亚家族引物均可获得扩增条带， 图2B显示了以第1组上游简并引物介导的第1轮PCR产物为模板， 第2轮中采用同组5种单一上游引物扩增的结果。βactin和Cβ编码基因经一轮PCR扩增即可获得目的条带（图片未显示）。图2A显示用含Vβ8亚家族引物的第4组简并PCR引物， 分别以1 000个、 100个、 10个Jurkat细胞提取RNA的为模板， 经巢式RTPCR扩增的结果。

　　2.2 基因克隆和序列分析 Vβ扩增产物经与Teasy载体连接后转化感受态受体菌， 经含氨苄青霉素、 Xgal和IPTG的平板筛选后， 随机挑出了15个克隆提取质粒进行菌落PCR和DNA序列分析。本研究的15个克隆序列与Vβ14参考序列的同源性均达到75%以上， 15个克隆的序列差异均主要在CDR3高变区， 保守区的序列均一致。

3 讨论

　　T细胞的特异性由TCR决定， 参与特异性细胞免疫应答的CD8 T细胞主要是TCRα/T细胞 ， 其多样性和特异性产生于TCR受体α和 链基因的VDJ重排。TCRα、 链的V区约含102～109个氨基酸， 由二个半胱氨酸形成链内二硫键， 组成约含50～60氨基酸残基的环肽， 是特异性识别外来抗原的结构域［8］。根据核苷酸序列同源性 75%的原则， α链分属32个亚家族， 链分属26个亚家族， 一些亚家族内还包括若干个分家族。TCRα 的种类约有107， 是从大约108个不同的TCRα异质双聚体天然前体池（pool of naive precursors）中选择出来的， 估计其代表的多样性>1018［3， 9］。正常情况下PBMC应能表达所有Vβ亚家族基因， 不同的Vβ亚家族T细胞所执行的功能有所不同， 在一些疾病中CD8 T细胞中的细胞毒T淋巴细胞（CTL）TCR Vβ表达谱可发生特有改变。我们曾对中国人群流行的乙型肝炎病毒（HBV）特异性CTL的表位特点进行了分析［10］， 如能进一步解析特异性CTL的TCR取用特点， 对阐明机体抗HBV特异性免疫应答机制将有重要意义， 同时克隆特异性CTL的优势TCR编码基因可用于抗HBV感染的基因治疗研究。

　　本研究拟在建立一种高效灵敏的TCR Vβ编码基因扩增方法。有报道采用24条引物介导RTPCR反应扩增24个TCR Vβ亚家族编码基因， 观察到TCR Vβ亚家族表达的不均衡性。但该方法要求用于扩增的细胞模板量较高， 扩增的各种Vβ亚家族编码基因片段大小差异较大， 且有少数TCR Vβ亚家族编码基因未能检出［11， 12］。为了能更广泛地覆盖Vβ各亚家族/分家族基因的差异序列， 同时获得长片段的各个Vβ亚家族编码基因， 我们设计了两组上游引物分别为34条外引物和37条内引物， 采用巢式RTPCR技术， 保障了方法的序列兼容性和敏感性; 采用8组简并上游引物（每组含45个引物）进行反应， 再根据情况在第2轮PCR中采用单一引物， 有利于提高工作效率。研究结果表明所建立的方法可有效扩增各个Vβ亚家族编码基因， 最少可从10个Jurkat细胞提取的RNA中扩增成功。我们设计的PCR引物有很好的亚家族特异性， 但分家族特异性不高， 难以完全区分各分家族特异性， 因此即使用单一引物扩增到的Vβ编码基因在序列上仍有较大异质性， 用PCR产物直接测序效果较差， 但通过克隆测序可以准确分析优势表达基因的序列。在分析的Vβ14亚家族基因的PCR产物克隆基因中， 15个克隆序列与Vβ14亚家族基因的同源性均大于75%， 序列差异主要在CDR3高变区。我们下一步将建立高效敏感的扩增TCR Vα方法， 并通过综合分析抗原特异性CTL TCR的α链和β链的表达谱特点， 深入了解疾病状态下的细胞免疫应答机制。

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