小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用

　　　　 作者：尹辉， 龚权， 杨衡， 熊平， 郑芳 龚非力

【摘要】 目的: 克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒， 初步探讨其表达产物sST2Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响。方法: 借助RTPCR技术， 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA， 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体（psST2Fc）。应用脂质体将重组质粒psST2Fc转染CHO细胞， 经G418筛选， 获得稳定表达sST2Fc融合蛋白的CHO细胞株。细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后， 采用Western blot进行鉴定， 应用FACS检测sST2Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况; ELISA法检测sST2Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNFα和IL6的影响。结果: 测序证实克隆和构建的小鼠sST2Fc cDNA阅读框序列正确， Western blot 证实sST2Fc融合蛋白的表达， sST2Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNFα和IL6。结论: 成功构建sST2Fc融合基因并获得稳定表达， sST2Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应。

【关键词】 小鼠sST2Fc; 真核表达; RAW264.7; TNFα; IL6

ST2 最早被认为是由成纤维细胞分泌的一种血清免疫应答产物， 随后发现肥大细胞［1］和Th3细胞［2］表面存在一种跨膜型ST2， 但其不表达在Th1细胞表面。目前证实ST2属于IL1受体超家族成员， 但不能与IL1家族成员IL1α、 IL1β或IL1R拮抗剂结合。由于在mRNA水平剪切方式的差异， ST2基因表达产物以跨膜型（ST2L）和分泌型(sST2)两种形式存在， 前者主要分布在源于造血细胞的细胞表面如肥大细胞和嗜酸性粒细胞， 而后者主要由成纤维细胞分泌产生。近来研究显示， ST2除了诱导免疫应答由Th1型向Th3型偏移， 还涉及到类风湿性关节炎、 过敏性哮喘等多种疾病的发生发展［3， 4］。我们通过构建小鼠sST2人IgG1 Fc重组质粒（psST2Fc）并表达可溶性ST2Fc融合蛋白， 观察其对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞生物学活性的影响， 为进一步应用该分子治疗炎症相关性疾病奠定基础。

1 材料和方法

　　1.1 材料 BALB/c小鼠(8～12周龄， 雄性)由湖北省医学实验动物中心提供; CHO细胞购自中国典型培养物保藏中心; RAW264.7巨噬细胞由华中科技大学同济医学院免疫学系保藏。单克隆大鼠抗小鼠ST2抗体购自R&&D公司。LPS和人IgG标准品购自Sigma公司， TRIzol试剂和脂质体LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司， RTPCR试剂盒购于MBI公司。各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Promega公司。Sepharose CL4B蛋白A亲和层析柱购自Amersham Biosciences。DNA合成和测序由Invitrogen (上海)完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组表达载体的构建 采用TRIzol试剂提取BALB/c小鼠脾细胞总RNA， 经RTPCR扩增全长sST2 cDNA。PCR 引物的序列为: 5′AAA ACA AGC TTG GCC GCC ACC ATG ATT GAC AGA CAG AG3′和5′AAA ACG GAT CCG AGC AAT GTG TGA GGG ACA CTC CT3′。采用Hind III和BamH I分别双酶切sST2和载体pcDNA3.1Fc， 将酶切片段sST2插入pcDNA3.1Fc载体Fc的上游， 构建重组表达载体psST2Fc， 转化E.coli DH5α宿主菌， 筛选阳性克隆， 经酶切和测序鉴定。

　　1.2.2 转染与筛选 用QIAGEN质粒试剂盒提取重组表达载体pcDNA3.1sST2Fc， 采用脂质体LipofectamineTM 2000转染CHO细胞， 同时转染空载体pcDNA3.1和未转染细胞作为阴性对照。具体方法为: CHO细胞在含100 mL/L胎牛血清的DMEM中， 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度下培养。转染前1 d， 细胞用2.5 g/L胰酶消化并接种于24孔培养板中（细胞数为1×105/孔）， 待细胞融合至70％～80％时， 按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行转染， 并设空载体和未转染组对照。培养48 h后， 加入G418(800 mg/L)筛选阳性抗药克隆。

　　1.2.3 sST2Fc蛋白的纯化及鉴定 收集细胞培养上清用Sepharose CL4B蛋白A亲和层析柱纯化sST2Fc融合蛋白， 纯化样品的浓度用A280吸收法测定。采用Western blot鉴定sST2Fc蛋白表达， 一抗为单克隆大鼠抗小鼠ST2抗体， HRP标记的兔抗大鼠为二抗， ECL化学发光法检测。

　　1.2.4 流式细胞术分析 RAW264.7巨噬细胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中， 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度下培养。刺激前1 d， 将RAW264.7巨噬细胞接种于6孔细胞培养板， 细胞数为2×106/孔， 次日加入LPS（1 mg/L）刺激， 同时设立LPS未处理组。继续培养24 h后收集细胞， 用预冷PBS洗涤3次， 细胞计数后分装于流式细胞管（1×105/管）。加入Fc封闭抗体， 4℃孵育30 min， 用PBS洗涤3次， 分别加入sST2Fc（0.5 mg/L）和hIgG（0.5 mg/L）， 4℃孵育30 min， 用PBA（1×PBS， 含20 mL/L胎牛血清和1 g/L叠氮钠）洗涤3次， 随后加入同型对照抗体和FITC标记的山羊抗人Fc抗体， 4℃避光作用30 min， PBS洗涤3次后， 进行流式细胞术检测。

　　1.2.5 RAW264.7巨噬细胞的培养和刺激 将RAW264.7巨噬细胞接种于24孔细胞培养板， 细胞数为5×105/孔， 第2天加入sST2Fc（0.5 mg/L）或hIgG（0.5 mg/L）， 同时设未处理对照组， 混匀培养3 h后， 加入LPS（1 mg/L）刺激， 继续培养至24 h收集培养上清， -80℃保存。

　　1.2.6 ELISA检测 采用ELISA检测试剂盒(eBioscience) 测定细胞培养上清中TNFα和IL6的水平。

　　1.2.7 统计学分析 数据以x±s表示， 采用t检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 重组sST2Fc表达载体的构建及鉴定 sST2 cDNA经RTPCR扩增， 酶切消化后， 插入pcDNA3.1Fc载体， 图1显示重组载体psST2Fc酶切后的片段大小与预期结果一致。序列测定结果表明， sST2序列与GenBank中注册的序列完全一致(GI: 2171234)。

　　2.2 sST2Fc融合蛋白表达的鉴定 CHO细胞培养上清经Shepharose CL4B蛋白A亲和层析纯化后， Western blot分析显示（图2）， 在转染psST2Fc实验组中出现一个特异性条带， 其相对分子质量（Mr）大小约100 000， 而在转染pcDNA3.1和未转染的对照组中未出现特异性条带。

　　图2 sST2Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达

　　A: SDSPAGE检测蛋白A亲和层析纯化sST2Fc蛋白; B: Western blot鉴定ST2Fc蛋白表达.2.3 sST2特异性结合RAW264.7巨噬细胞 为了检测RAW264.7巨噬细胞表面是否存在sST2相应受体， 用流式细胞术分析sST2的特异性结合能力。图3显示， 在封闭RAW264.7巨噬细胞表面Fc受体后， sST2能特异性结合于RAW264.7细胞表面， 并且其结合强度伴随LPS刺激而显著上升。

　　图3 sST2特异性结合巨噬细胞表面相应受体

　　A: RAW264.7巨噬细胞表面存在特异性sST2受体. 流式细胞术检测hIgG (点线) 和sST2Fc(粗线) 与巨噬细胞表面相应受体结合 (其中细线代表同型对照). B: LPS上调RAW264.7巨噬细胞表面sST2受体表达. 巨噬细胞在LPS刺激前(点线)和刺激后(粗线)， sST2受体表达变化 (其中细线代表同型对照).

　　2.4 sST2抑制LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌的TNFα和IL6 在LPS刺激下， RAW264.7细胞能上调结合sST2的能力， 故进一步检测sST2对LPS激活巨噬细胞的生物学活性影响。在sST2或hIgG预处理RAW264.7巨噬细胞3 h后， 加入LPS（1 mg/L）继续培养至24 h， 用ELISA检测不同时间点细胞培养上清中TNFα和IL6的水平。结果显示（图4）， sST2能明显抑制LPS刺激巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNFα和IL6， 而hIgG对照组则无此作用（P&<0.05）。

3 讨论

　　在细菌裂解产物如细菌脂蛋白、 LPS等因素刺激下， 巨噬细胞可产生大量的炎性细胞因子包括IL1α/β、 IL12、 TNFα及各种炎性介质如热休克蛋白（HSP）、 氧自由基等， 它们在诱导机体产生天然免疫应答向特异性免疫应答偏移中发挥了重要作用［5］。广泛性的细菌感染能引起这些炎症物质产生混乱， 最终导致多器官衰竭和内毒素休克。ST2可通过调节Th1/Th3型免疫应答偏移而影响疾病的转归， 而且在炎性因子IL1α/β和TNFα刺激下， 成纤维细胞分泌sST2的水平上升; 经LPS预处理的人单核细胞产生sST2的水平亦增加， 这些结果均提示sST2可能参与了炎症反应的调节作用［6］。

　　巨噬细胞表面与sST2特异性结合的受体及其相应功能尚未完全清楚。虽然ST2与IL1R具有高度同源性， 但未能发现它与已知的IL1家族成员IL1α、 IL1β或IL1R拮抗剂结合。目前， 巨噬细胞表面特异性ST2结合蛋白的cDNA序列已被克隆鉴定， 但是由该蛋白所介导的胞内信号传递途径尚待明确［7］。现已知， ST2结合蛋白含有一个跨膜端以及由12个氨基酸短肽组成的胞内端， 故推测它可能与巨噬细胞识别sST2并介导下游相应的信号传递有关。本实验通过流式细胞术应用重组sST2Fc融合蛋白证实RAW264.7巨噬细胞表面存在特异性的ST2结合蛋白， 并且ST2结合蛋白的表达水平在LPS刺激下显著上升。或有可能， 与sST2结合的相应受体是巨噬细胞表面一种未知的IL1R家族新成员， 这有待进一步研究。

　　为了评价sST2在巨噬细胞所介导炎症反应中的作用， 我们检测了sST2Fc融合蛋白对LPS激活巨噬细胞的生物学活性影响。结果显示， ST2Fc融合蛋白预处理组能明显地抑制LPS诱导巨噬细胞产生的炎性细胞因子TNFα和IL6。亦有文献报道［8］， sST2能有效抑制肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子TNFα、 IL1和IL6的基因转录和蛋白表达， 而抗炎性细胞因子IL10、 TGFβ及NO的表达水平未受影响， 从而证实sST2通过直接与细胞表面受体相结合而发挥作用， 并非通过间接途径。并且， sST2预处理可明显抑制巨噬细胞TLR4受体mRNA的转录， 这种下调LPS相应受体信号途径的能力， 在一程度上解释了sST2对炎症反应的调节作用。由此可见， 通过进一步明确下调巨噬细胞所介导炎症反应的作用机制， sST2有望成为一种治疗内毒素休克及炎症相关性疾病的新途径。

参考文献

［1］ Moritz DR， Rodewald HR， Gheyselinck J， et al. The IL1 receptorrelated T1 antigen is expressed on immature and mature mast cells and on fetal blood mast cell progenitors［J］. J Immunol， 1998， 161(9): 4866-4874.

［2］ Xu D， Chan WL， Leung BP， et al. Selective expression of a stable cell surface molecule on type 2 but not type 1 helper T cells［J］. J Exp Med， 1998， 187(5): 787-794.

［3］ Leung BP， Xu D， Culshaw S， et al. A novel therapy of murine collageninduced arthritis with soluble T1/ST2［J］. J Immunol， 2004， 173(1): 145-150.

［4］ Hayakawa H， Hayakawa M， Kume A， et al. Soluble ST2 blocks interleukin33 signaling in allergic airway inflammation［J］. J Biol Chem， 2007， 282(36): 26369-26380.

［5］ 尹华华， 朱京慈， 李 磊. 巨噬细胞的异质性［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2004， 20(4): 510-512.

［6］ Kakkar R， Lee RT. The IL33/ST2 pathway: therapeutic target and novel biomarker［J］. Nat Rev Drug Discov， 2008， 7(10): 827-40.

［7］ Gayle MA， Slack JL， Bonnert TP， et al. Cloning of a putative ligand for the T1/ST2 receptor［J］. J Biol Chem， 1996， 271: 5784-5789.

［8］ Sweet MJ， Leung BP， Kang D， et al. A novel pathway regulating lipopolysaccharideinduced shock by ST2/T1 via inhibition of Tolllike receptor 4 expression［J］. J Immunol， 2001， 166: 6633-6639.