卡介苗经TLR4介导对膀胱癌细胞株T739 NFκB p65活性影响

　　　　　　作者：危建安， 曾星， 韩凌， 黄羽

【摘要】 　　目的: 探讨卡介苗(BCG)对膀胱癌细胞株T739 经Toll样受体介导的NFκB p65活性影响。方法: 采用SYBR Green嵌合荧光定量Real TimePCR， 观察BCG(0.25g/L)刺激T739后不同时间点各个mRNA相对表达量（Ratio）， 设LPS和空白组作对照; 采用转录因子结合DNA的ELISA方法检测NFκB p65活性。结果: BCG刺激后T739细胞TLR2、CD14和MD2 mRNA表达均明显增加， Max.Ratio分别为5.3(2 h)， 2.6 (4 h)， 7.4(2 h)， TLR4 mRNA增加不显著， Max.Ratio为1.6（6 h）; BCG作用T739细胞后NFκB p65活性显著增加， 阻断TLR4后，NFκB p65活性受到显著抑制（P&<0.05）; 阻断TLR2后NFκB p65活性却显著性增强（P&<0.01）。结论: BCG作用T739后TLR2、CD14、MD2 和TLR4 mRNA表达均不同程度增加， BCG可经TLR4使T739细胞NFκB p65活性增强， 不是经TLR2使T739细胞NFκB p65活化。

【关键词】 卡介苗; 膀胱癌; 信号转导; 核转录因子κB p65

　　卡介苗(bacillus CalmetteGuérin， BCG)膀胱内灌注治疗和预防浅表性膀胱癌， 是目前较成功的肿瘤免疫治疗。其作用认为与BCG诱导并增强了免疫反应尤其是局部的细胞免疫有关， 但尚不能完整阐释其机制。天然免疫的研究发现［1］: 上皮、内皮细胞等可通过其表面的Toll样受体(tolllike receptors， TLRs)识别与其接触的病原微生物， 产生免疫反应。我们推测BCG也可能刺激膀胱移行上皮细胞TLRs， 通过激活Toll信号转导通路而增强抗肿瘤免疫反应。因此本研究拟用BCG刺激膀胱癌细胞株T739， 探讨其对Toll信号转导相关膜分子TLR2、TLR4、CD14和MD2 mRNA基因表达影响， 及用中和抗体分别阻断TLR2或TLR4观察NFκB 活性变化。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　实验用膀胱癌细胞株(BTTT739， 简称T739)源于小鼠低分化移行上皮细胞膀胱癌， 购自上海市第一人民医院中心实验室［2］， BCG为本室保存。革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)为Sigma进口分装。RNAprep cell kit、 DNase I、 TIANScript RT Kit和SYBR Green荧光染料qRTPCR试剂均购自天根生化科技公司; RNase H购自Invitrogen公司; 引物自行设计由Invitrogen公司合成; RPMI1640培养基和新生牛血清购自Gibco公司; Nuclear Extraction Kit购自Chemicon公司， 抗干扰Lowry法蛋白定量试剂购自珠海健康元公司， NFκB p65 Transcription Factor Assay Colorimetric System购自Upstate公司， TLR2、 TLR4/MD2 mAb购自Santa Cruz公司; 酶标仪(型号550， Biorad公司)， 普通PCR仪和荧光定量PCR仪(型号9600和7700， ABI公司); 高速低温离心机(型号GR15S， BECKMAN公司); 凝胶成像系统(Gel doc XR型， BIORAD公司); 细胞培养箱(HARRIS公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 BCG和细胞培养

　　将BCG接种于Middlebrook7H9培养基中， 置于37℃静置培养， 待其生长至对数生长期使用。在使用前收集BCG， 用PBS洗涤， 称重， 用RPMI1640培养液调整培养基终浓度为0.25 g/L。T739细胞在含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培养基， 37℃、50 mL/L CO2的培养箱中培养， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代细胞。分为空白组、LPS组和BCG组共3组， 空白组不作任何处理， LPS组终浓度为100 μg/L， BCG组终浓度为0.25 g/L（参考以往实验的剂量［3］）， 观察时间点为0、1、2、3、4、6、8 h、12 h等共8个， 每个时间点作3个样本， 观察指标为TLR2、 TLR4、 CD14和MD2 mRNA的表达。

　　1.2.2 总RNA提取与cDNA合成

　　总RNA提取: 采用RNAprep cell kit吸附柱提取法， 按试剂盒说明书操作， 并加用DNase I去除基因组DNA。加入30μL RNAsefree h3O收集RNA溶液。取10 μL稀释至1 mL， 用A260/A280检测总RNA浓度和纯度。cDNA合成: 在冰浴条件下进行， 总RNA取样4μg， 引物为oligo(dT)15， 逆转录酶TIANScript MMLV， 终体积为20μL， 反应温度42℃50 min， 95℃5 min终止反应; 加RNase H1 M1(2U)， 降解RNA。用GAPDH引物进行RTPCR扩增BCG组总RNA和逆转录产物考查反转录效果， 并考查BCG处理对GAPDH mRNA表达是否有影响。

　　1.2.3 引物设计

　　应用Invitrogen公司在线引物设计软件OligoPerfectTM Designer设计， 采用BLAST进行比对， 由Invitrogen公司合成。设计的引物相关情况见表1。

　　1.2.4 q RTPCR检测mRNA表达方法

　　1.2.4.1 q RTPCR检测原理

　　本实验采用SYBR Green嵌合染料荧光法进行Real TimePCR， 用ROX染料作参比; 用比较CT法进行相对定量， 应用靶基因和看家基因CT值计算靶基因相对看家基因GAPDH表达量， 以0 h为比较基准， 求出各组不同时间点mRNA的相对表达量（Ratio）， 采用Pfaffl［4］推导的数学公式计算目的基因的相对表达量， Ratio=EtargetCT(controlsample)/Eref CT(controlsample)， 其中Etarget和Eref分别表示靶基因和看家基因扩增效率， CTcontrol 和CTsample分别表示0 h和不同时间点样本的CT值。表1 实验中应用的引物情况（略）

　　1.2.4.2 特异性和重复性

　　各个特异性引物的扩增产物进行20g/L凝胶电泳分析特异性， 取稀释9倍的cDNA 1μL为模板， 反应体系20μL， 变性和延伸为试剂盒推荐温度， 调整PCR退火温度（50℃～62℃）， 以条带最为单一清晰者作为RTPCR反应退火温度， 并作测序鉴定。取1份逆转录产物作模板， 连续3d， 1次/d， 5复孔/次进行RTPCR扩增， 考察重复性。

　　1.2.4.3 扩增效率

　　取反转录产物cDNA作3倍梯度稀释4次(1， 1∶3， 1∶9， 1∶27和1∶81)， 每个浓度各取1 μL cDNA作实时荧光定量PCR， 分别扩增靶基因和GAPDH基因， 每个浓度作复孔。荧光PCR仪自动读出CT值， 并以模板浓度的对数为横坐标， CT值为纵坐标， 绘制出标准曲线， 自动算出曲线的斜率(slope)， 并根据公式E=10［-1/slope］计算出扩增效率(1.0≤E≤2.0)。

　　1.2.4.4 PCR反应

　　取稀释9倍的cDNA 2μL作为模板， 依次加入2.5×SYBR solution Mix 9μL， 上、下游引物(4 μmol/L)各1μL， 超纯水7μL， 反应体系为20μL。在7700荧光PCR仪上进行扩增。反应条件: 94℃ 3min; 94℃ 20s， 60℃20 s， 68℃30 s共40个循环。

　　1.2.5 NFκB p65活性检测

　　1.2.5.1 实验分组和处理

　　T739细胞在含100mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液培养， 待细胞融合至80%～90%， 分5组， 第1组: 空白组; 第2组: 含LPS 100μg/L完全培养液; 第3组: 含BCG 0.25 g/L完全培养液; 第4组: 先用含1 mg/L TLR2抗体的完全培养液37℃孵育30 min， 更换为含BCG 0.25 g/L完全培养液， 第5组: 先用含1mg/L TLR4MD2抗体完全培养液37℃孵育30 min， 更换为含BCG 0.25 g/L完全培养液。

　　1.2.5.2 核蛋白提取与定量

　　各组加药作用2h后用2.5g/L胰蛋白酶消化收集细胞， 按照Nuclear Extraction Kit说明书， 用冰冷PBS洗涤， 250g离心5 min， 4℃， 先用冰冷1×Cytoplasmic Lysis Buffer裂解细胞， 再用细胞沉积2/3体积的Nuclear Extraction Buffer， 获取核提取物。按照抗干扰Lowry法蛋白定量试剂说明书操作， 要求定量标准曲线r&>0.99， 求出样品原浓度， 再用冰冷PBS调整各样品浓度至2.5g/L用于活性检测。

　　1.2.5.3 NFκB p65活性比色检测

　　检测原理是采用生物素化捕获探针（包含NFκB结合的共有序列5′GGGACTTTCC3′）与定量的核提取物混合孵育作为样品， 与包被抗生物素板结合， 根据ELISA原理， 按NFκB p65 EZTFA Transcription Factor Assay(TFA)试剂盒说明书检测， 检测样品准备方法如表2。表2 NFκB p65活性检测的样品准备(略)

　　1.2.6 统计学分析

　　q RTPCR检测mRNA表达以0 h作为参照计算其他时间点Ratio值， 取0h3个样本CT平均值为为公式中CTcontrol。用Excel软件进行统计， 取每个时间点3个样本Ratio平均值做相对定量分析， 将Ratio&>=2.0或&<=0.5认为表达有差异［6］。NFκB p65活性实验各组之间进行方差齐性检验后采用t检验， 由Excel软件完成。

　　2 结果

　　2.1 总RNA提取、反转录与内参基因有效性考查

　　总RNA提取纯度(A260/A280) 在1.6～2.1之间， 符合PCR实验要求。用GAPDH引物RealTtimePCR扩增BCG组总RNA和逆转录产物， 总RNA扩增曲线未见电泳条带， 逆转录产物均有S形荧光曲线和清晰条带（图1）， 表明总RNA提取无基因组DNA污染。1 h～12 h的7个时间点样本平均CT值与0 h平均CT值比较， P&>0.05时差异无统计学意义， 表明BCG处理T739细胞对GAPDH mRNA表达无明显影响， GAPDH mRNA作为内参基因有效。

　　2.2 PCR扩增特异性、重复性和扩增效率

　　对各个特异性引物的扩增产物进行20 g/L凝胶电泳分析， 各基因条带均清晰的退火温度为60℃， 特异性最佳， 并测序鉴定与NCBI序列一致（图2）。各个基因RTPCR的CT值批内变异系数均&<3.0%， 批间变异系数均&<5.0%。逆转录产物梯度稀释5个浓度， CD14， TLR2， TLR4， MD2， GAPDH各基因RTPCR的标准曲线的相关系数(r)均大于或等于0.99、 扩增效率(E)分别为1.78、 1.87、 1.80、 1.80和1.99。

　　2.3 卡介苗对TLR2、TLR4、CD14和MD2 mRNA表达的影响
　　BCG 组TLR2、CD14和MD2 mRNA的Max. Ratio分别为5.3 (2 h)、 2.6(4 h)和7.4倍(2 h)， TLR4 mRNA仅为1.6(6 h); LPS组CD14和TLR4 mRNA的Max. Ratio分别为2.1 (1 h)和3.2(6 h)， TLR2和MD2mRNA无明显变化。空白组上述所有检测基因的各时间点均在0.5～2.0波动， 无最大或最小Ratio值。BCG 组具体结果见图3。

　　2.4 BCG对T739细胞NFκB p65活性影响及TLR2/TLR4的介导作用

　　T739细胞空白组胞核NFκB p65活性较低， BCG组和LPS组NFκB p65活性较空白组均有显著性提高， BCG和LPS组之间无统计学意义; TLR2/BCG组NFκB p65活性较BCG组和LPS组显著增加（P&<0.01）; TLR4MD2/BCG组NFκB p65活性较BCG组降低， 差异有统计学意义（P&<0.05）， 与空白组无统计学意义（图4)。

　　3 讨论

　　BCG膀胱内灌注治疗和预防浅表性膀胱癌复发， 其抗肿瘤机制多认为是与BCG诱导局部天然免疫有关， 而临床实践中BCG很少用于其他肿瘤治疗， 用于其他肿瘤治疗疗效也不如用于治疗浅表性膀胱癌， 这表明BCG治疗膀胱癌不只是激活癌组织周围天然免疫细胞， 还有其他途径和机制发挥抗肿瘤效应， 否则治疗其他肿瘤也能取得同样疗效。有研究报道［6］在人类膀胱癌细胞株可被BCG诱导表达TLR2和/或TLR4， 在大肠杆菌和LPS刺激后释放致炎因子［7， 8］。因此， 我们推测， BCG灌注治疗膀胱癌， BCG可刺激膀胱上皮细胞的TLRs， TLRs接受BCG的刺激信号， 引起Toll受体介导的信号转导， 诱导抗肿瘤的免疫反应， 故课题组设计了该实验研究。
　　
　　在实验技术方面， 我们选择比较CT值相对定量方法（qRTPCR）进行mRNA表达定量。比较CT值法优点在于， 该法既无需标准曲线定量法制备标准品的复杂性， 又较凝胶成像光密度扫描PCR终产物的定量方法准确。该方法运用的数学公式Ratio=EtargetCT(controlsample)/ErefCT(controlsample)考虑到靶基因与内参基因扩增效率的可能不一致性， 可避免Ratio=2-ΔΔCT公式忽略扩增效率的不足。NFκB p65活性检测是采用生物素化捕获探针（包含NFκB结合的共有序列5′GGGACTTTCC3′）与一定量的核提取物混合孵育作为检测样品， 后续根据ELISA方法检测NFκB p65活性， 与胶体位移分析、 Western blot和报告基因分析方法比较， 该方法易定量、 灵敏度高。

　　BCG对T739细胞TLR2、 TLR4、 CD14和MD2 mRNA表达的影响， 结果显示BCG刺激膀胱癌细胞T739后， 可引起信号转导相关膜分子TLR2和CD14、 MD2 mRNA表达增加， 对TLR4 mRNA表达无明显增加， 出现CD14、 MD2 与TLR4 mRNA表达不同步的现象， 此原因原因可能有多种， T739细胞是一种癌细胞， 不同于正常细胞， TLR4基因表达过程可能受阻或受某些因素限制， 未出现同步增加， 此推测是否正确有待于深入研究; 也有可能不同细胞株受BCG刺激后免疫相关基因表达不同， 杨玉琮等［9］的研究似乎也说明这一点， 采用SSH技术筛选和鉴定同一膀胱癌亚克隆细胞株与BCG免疫相关基因（BIG）的差异表达， 结果表明不同亚克隆细胞株BIGM103等免疫相关基因表达有显著不同， 并认为这可能与不同膀胱癌细胞对BCG免疫治疗的差异性有关。
　　
　　BCG对T739细胞NFκB p65活性影响， 结果发现BCG组NFκB p65活性显著性高于空白组（P&<0.05）， 表明BCG可以向T739细胞信号转导; 用抗TLR4MD2抗体封闭T739细胞表面TLR4MD2， 发现TLR4MD2抗体可显著阻断BCG对T739细胞NFκB p65活性增强作用， 表明BCG可经TLR4MD2膜分子活化T739细胞NFκB p65。BCG可显著增加T739细胞TLR2 mRNA表达， 用抗TLR2抗体封闭T739细胞表面TLR2， 发现封闭TLR2后BCG可显著促进T739细胞NFκB p65活性增强， 而未出现NFκB p65活化受阻断， 这一现象作者目前难以解释， 推测可能是BCG既可通过TLR4MD2活化T739细胞NFκB p65， BCG同时又可经TLR2向T739细胞转导其他未知的信号通路并可引起NFκB p65活性降低， 当封闭TLR2后抑制BCG对T739细胞该未知通路信号转导， 则经TLR4通路的NFκB p65活化增强现象充分表现出来。
　　
　　国外也有该方面的研究报道， Means等［10］发现， BCG活菌可通过TLR2和TLR4介导细胞内信号传递， 而热灭活的BCG只能激活TLR2。Murata［11］研究表明纯化的BCG细胞壁骨架(SMP105)能通过活化TLR2显著增强免疫应答如INFγ产生细胞和CTL细胞的数量， 且能防止肿瘤细胞的生长， 而无TLR4的作用。Brightbill也发现类似结果。Hertz等［12］用结核杆菌裂解产物19kDLP制备的合成脂肽(Lipopeptide)只能与TLR2结合。以上研究似乎有一特点， 灭活BCG或其组分以刺激TLR2为主， 活体BCG可以刺激TLR2和TLR4。这一特点与我们的研究结果有所不同， 有待深入探讨其机制。

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