棕榈酸抑制胰岛MIN6 β细胞生长的分子机制

　　　　 作者：崔巍， 黄葶， 刘均利， 施秉银

【摘要】 　　目的: 观察饱和脂肪酸棕榈酸（Palmitate， PA）对小鼠MIN6β细胞生长的影响， 从细胞周期角度来探讨其发生的分子机制。方法: 采用5 g/L BSA代替血清培养36 h使MIN6细胞同步化处于G0期。然后用PA（0.25～1.0 mmol/L， 45 min～24 h）干预， 采用MTT法检测细胞活力， 流式细胞术测定细胞周期， 采用Westen blot检测细胞周期相关蛋白CDK4、 CyclinD1表达水平的变化。结果: 和对照组相比（1）不同浓度PA均显著抑制MIN6细胞增殖（P＜0.01); （2）PA亦能明显抑制细胞周期进程， 使MIN6细胞周期更多滞留在G0/G1期(P&<0.01)， G2/M期与S期细胞比例降低(P&<0.01); （3）PA能显著的抑制细胞周期相关蛋白CDK4、 CyclinD1的表达（P＜0.05）， 并与细胞周期延迟一致。结论: PA抑制MIN6β细胞生长可能是通过降低MIN6β细胞的细胞周期相关蛋白cyclin D1/CDK4的表达， 导致从G1S期的阻滞， 从而减弱细胞增殖。

【关键词】 胰岛β细胞; 棕榈酸; 细胞周期; 增殖

　　［Abstract］AIM: To investigate the effect of saturated fatty acid Palmitate (PA) on cell viability of MIN6 βcell and the possible cell cycle pathways affected by PA. METHODS: MIN6 cells were synchronized at G0 phase by serum deprivation for 36 h， and further MIN6 cells were exposed to different concentrations of PA（0.25-1.0 mmol/L， 45 min-24 h）compared with control cell treated with BSA.Cell viability was assessed by MTT colorimetric assay. The cell cycle was measured by FACS analysis， and cell cycle proteins were further detected using Western blot. RESULTS: (1) PA significantly affected the cell viability of MIN6 cells. (2) The G0/G1 cell cycle arrest (n=6， P&<0.05) also induced by PA， whereas MIN6 cells in S and G2/M phase were decreased. (3) For cell cycle proteins， PA treatment caused significant reductions in cyclin D1 and CDK4 levels， which was consistent to the cell cycle delay. CONCLUSION: The findings thus suggest that increased PA directly affects pancreatic βcell proliferation， possibly by reducing the levels of cyclin D1/CDK4 in the cells， which results in arresting in progression through the G1 phase to the S phase of the cell cycle.

　　［Keywords］pancreatic βcells; Palmitate; cell cycle; proliferation

　　在肥胖个体和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）患者中常有饱和游离脂肪酸（free fatty acids， FFA）的升高， 研究发现， 饱和FFA的升高可能与胰岛β细胞凋亡和功能障碍及胰岛素抵抗密切相关。本实验以小鼠MIN6 胰岛β细胞瘤株（以下简称MIN6细胞）为实验对象， 观察不同浓度饱和脂肪酸（棕榈酸， Palmitate， PA）对体外培养下的MIN6细胞的生长的影响， 进而从细胞周期角度来探讨其发生的分子机制。

　　1 材料和方法

　　1．1 材料

　　MIN6β细胞株(16－30代)由加拿大McGill大学刘均利教授提供。DMEM培养基、胎牛血清(Gibico)、AntibioticAntimycotic (100X)购自Invitrogen 公司。ECL高级 Western blotting 检测试剂盒购自Amersham公司， 抗小鼠cyclinD1， CDK4多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司， 辣根过氧化物酶结合二抗购自美国Jackson Immunolaboratories。无FFA的牛血清白蛋白（BSA）及其余化学试剂均购自美国Sigma公司。

　　1．2 方法

　　1．2．1 游离脂肪酸的配制

　　用0.1 mol/L的NaOH溶液在70℃水浴中溶解一定量的PA， 振荡混匀10 min， 然后过滤， 配成100 mmol/L的PA储存液。在55℃水浴中用去离子水配50 g/L的BSA溶液， 过滤。然后将上述的PA溶液和BSA溶液按1∶19的体积比混合配成5 mmol/L PA/50 g/L BSA复合液。复合液在水浴中振荡10 s后继续水浴10 min， 取出后冷却至室温， 过滤。然后将上述复合液分别用无血清的含葡萄糖25 mmol/L的DMEM培养液以1∶5和1∶10的比例稀释成1.0 mmol/L PA/1 g/L BSA和0.5 mmol/L PA/5 g/L BSA的终浓度; 用无血清的含葡萄糖25 mmol/L的DMEM培养液以1∶10和1∶20的比例稀释成0.5 mmol/L PA/5 g/L BSA和0.25 mmol/L PA/2.5 g/L BSA的终浓度［1］。

　　1．2．2 细胞培养

　　MIN6细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液（25 mmol/L葡萄糖， 10 mmol/L的丙酮酸钠， 10 mmol/L的HEPES， 2 mmol/L的L谷氨酰胺， 及55 μmol/L的β巯基乙醇， 10 mL/L AntibioticAntimycotic）在37℃ 50 mL/L CO2的细胞孵箱中培养， 待到MIN6细胞(1820代) 80%左右贴壁， 弃去原有培养液， 用无血清的含5 g/L BSA和0.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液对细胞进行36 h同步化培养。然后用无血清25 mmol/L葡萄糖DMEM培养液含不同浓度的PA和BSA进行干预， 分组如下: (1)2.5 g/L BSA; (2) 5 g/L BSA; (3)10 g/L BSA; (4)0.25 mmol/L PA/2.5 g/L BSA; (5)0.5 mmol/L PA/5 g/L BSA; (6)1 mmol/L PA/10 g/L BSA。

　　1．2．3 MMT法测定细胞增殖情况

　　将MIN6细胞按每孔5×103种于96孔培养板， 待细胞80%贴壁， 细胞同步化36 h， 弃去原有培养液， 加入含不同浓度PA/BSA的培养液干预。实验组分别是终浓度为0.25、 0.5、 1 mmol/L的PA; 同时分别设3组含2.5、 5、 10 g/L BSA的对照组。每组10个复孔， 每孔总反应体系为200 μL。按照设定的时间6 h， 16 h和24 h， 在倒置显微镜下观察细胞并记录细胞形态; 然后每孔加入MTT 10 μL， 继续培养4h。弃去上清液， 每孔加入二甲基亚砜150 μL， 振荡10 min， 酶标仪（Spectramax M2 Molecular Devices）测定550 nm下各个组实验对象的吸光度。

　　1．2．4 细胞周期分析

　　将MIN6细胞按每孔5×104种于12孔培养板， 待细胞80%贴壁， 细胞同步化36 h， 弃去原有培养液， 加入含不同浓度PA/BSA的培养基。每组设3个复孔。干预24 h分别消化细胞， 离心收集悬浮和贴壁细胞， 用4℃ 预冷的PBS缓冲液洗细胞2遍后， 然后用结合缓冲液重悬细胞， 调节细胞的密度为109/L。每个样本取100 μL的细胞悬液， 加入10 μL的碘化丙锭（PI， 20 mg/L）溶液和100 mg/L RNA酶的结合缓冲液， 混匀后置于37℃水浴箱30 min， 在每个样本中加入400 μL结合缓冲液， 上细胞流式仪（BD公司， 型号: FACSCalibur)测量细胞周期分布并分析。

　　1．2．5 蛋白的分析

　　将MIN6细胞按每孔106种于100 mm有盖培养皿， 待细胞80%贴壁， 细胞同步化36 h， 弃去原有培养液， 加入含不同浓度PA/BSA的培养液。每组设3个， 按照设定的时间45 min、6 h、 16 h和24 h， 采用蛋白裂解液（150 mmol/L NaCl， 10 mmol/L Tris， pH7.4， 1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA， 100 mL/L Triton X100， 5 mL/L Nonidet P40， 100 mmol/L NaF， 10 mmol/L焦磷酸钠， 10 mmol/L原钒酸钠， 蛋白酶抑制剂Roche Applied Science）在4℃提取细胞蛋白。用Brad法蛋白定量， 50μg蛋白被130 mL/L聚丙烯酰胺、1 mL/L SDS胶分离， 再转移到醋酸纤维素膜， 转印膜用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h， 然后加入特异性一抗， 4℃冷室中过夜。用TBST洗膜3次， 每次10 min， 再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(用封闭液1∶5 000稀释)， 室温孵育1h。用TBST洗膜3次， 每次10 min。用增敏化学发光底物试剂检测。使用Flurochem 8900(Alpha Innotech)采集图像， 再用AlphaEase软件(Alpha Innotech)分析。

　　1．2．6 统计学分析

　　所有实验数据以x±s表示。使用InStat 软件 version 3(美国， GraphPad Software)分析， 采用单因素方差分析进行组间比较， 两组比较采用成组设计资料t检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2．1 不同浓度的PA对MIN6细胞生长的影响

　　用不同浓度的PA分别作用细胞6h、16h和24h。与对照组相比， 在各时间点， 0.5 mmol/L、1.0 mmol/L PA均能抑制细胞生长， 且作用呈时间与剂量依赖性。其中0.5 mmol/LPA在各时间段作用下的细胞生长程度仅为对照组的53%、48%和33%（P＜0.01）; 1.0 mmol/L PA在各时间段作用下的细胞生长程度仅为对照组的52%、33%和22%（P＜0.01）; 而0.25mmol/L PA仅在16 h点抑制细胞生长， 为对照组的69%; 其中以1.0 mmol/L PA的抑制作用更为明显（P＜0.01， 图1）。

　　2．2 不同浓度PA对MIN6细胞周期的影响

　　用0.5mmol/L、1.0 mmol/L PA分别作用细胞24 h。与对照组相比， 0.5mmol/L、1.0 mmol/L PA均可使细胞周期阻滞于G0/G1期， 细胞比例分别明显上升至（70.2±4.5）%和（81.3±1.6）%; G2/M期与S期细胞比例降低， G2/M期细胞比例分别降至(16.0±3.5)% 和(11.5±2.6)%; S期细胞比例分别降至(13.8±1.5)% 和(7.2±1.2)%， 其中1.0 mmol/L PA作用更加明显（图2）。

　　2．3 Western blot测MIN6细胞周期相关蛋白CDK4和cyclinD1

　　用0.5mmol/LPA 分别作用细胞45min、6h、16h和24h， 以5 g/L BSA处理为对照组。Western blot方法测各实验组细胞周期相关蛋白CDK4和cyclinD1的表达。与对照组相比， 随着时间推移， PA组CDK4蛋白表达量明显降低， CDK4/βactin 明显降低， 6h， (60±5)%， (P&<0.01); 16h， (51±5)%， (P&<0.01); 24 h， (87±4)%， (P&<0.01)(图3A)， 而在45 min点无统计学意义（P＞0.05）。同样发现: 与对照组相比， 随着时间推移， PA组cyclinD1蛋白表达量明显降低， cyclinD1/βactin 明显降低， 45 min， (54±7)%， P&<0.01; 6h， （60±5）%， （P&<0.01）; 16h， （42±6）%， （P&<0.01）（图3B)， 而在24 h点无统计学意义。

　　3 讨论

　　肥胖是T2DM发生的一个主要危险因素， 过多的脂肪组织可使饱和FFA的释放增加， 长期高水平的FFA则促进胰岛β细胞凋亡和引起细胞坏死， 其中以诱导细胞凋亡为主， 称为脂性凋亡， 最终导致细胞数量减少［2， 3］。近年来研究证明在小鼠出生后， 胰岛β细胞的复制速率尽管较低， 在维持胰岛β细胞的数目起着重要作用， 并且在部分胰腺切除后， 胰岛β细胞的复制亦起着关键作用［4］。然而目前关于饱和FFA对影响胰岛β细胞的自我分化及再生的机制还不清楚。

　　本实验中所用的MIN6细胞能稳定表达GLUT2和葡萄糖激酶并保持对糖的反应性， 与原代胰岛相似， 是研究β细胞增殖和凋亡因素的理想模型［5］。本研究结果显示: PA可抑制细胞活力与生长， 且作用呈时间与剂量依赖性。在细胞周期调控中， G1S期之间调控点是细胞内外信号传递、 整合汇集到细胞核对细胞的增殖进行调控的关键点。本研究结果显示: PA可使细胞周期阻滞于G0/G1期， 降低S和G2/M期细胞比例。提示: PA抑制细胞的增殖是通过抑制G0/G1期向S期的转换， 阻滞细胞周期进程， 影响其复制。

　　细胞周期G1S期之间调控点的异常与胰岛β细胞复制密切相关。与之相关的Cyclin D1、CDK4和pRb（磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白）等共同组成一条重要的细胞周期调节通道。pRb磷酸化状态与细胞周期调控密切相关， 低磷酸化时有活性， 抑制细胞进入DNA合成期(S期); 在Cyclin D1/CDK4复合物的作用下发生磷酸化而失活; 高磷酸化状态的pRb释放转录因子E2F， 细胞即由G1期进入S期［6， 7］。本研究结果证实: MIN6细胞在PA干预下， Cyclin D1、CDK4表达明显受抑， Cyclin D1抑制更早于CDK4， 结合本研究细胞周期结果， 提示: PA可能通过抑制Cyclin D1/CDK4复合物， 抑制磷酸化pRb， 从而抑制G0/G1期向S期的转换， 阻滞细胞周期进程， 影响其复制。
　　
　　综上所述， 本实验证实了饱和脂肪酸PA能够抑制MIN6细胞的生长和复制， 显示出其对β细胞的细胞毒性作用。可能是通过降低cyclin D1和CDK4活性， 使细胞滞留在G0/G1期， 抑制细胞周期进程， 影响其复制。

参考文献

　　［1］Karaskov E， Scott C， Zhang L， et al. Chronic Palmitate but not Oleate exposure induces endoplasmic reticulum stress which may contribute to INS1 pancreatic βcell apoptosis［J］. Endocrinology， 2006， 147(7): 3398-3407.

　　［2］Shimabukuro M， Zhou YT， Levi M， et al. Fatty acidinduced βcell apoptosis: a link between obesity and diabetes［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95(5): 2498-2502.

　　［3］Diakogiannaki E， Morgan NG. Differential regulation of the ER stress response by longchain fatty acids in the pancreatic betacell［J］. Biochem Soc Trans， 2008， 36 (Pt 5): 959-962.

　　［4］Dor Y， Brown J， Martinez OI， et al. Adult pancreatic βcells are formed by selfduplication rather than stemcell differentiation［J］. Nature， 2004， 429(6987): 41-46.

　　［5］Hohmeier HE， Newgard CB. Cell lines derived from pancreatic islets［J］. Mol Cell Endocrinol， 2004， 228(1-2): 121-128.

　　［6］Fatrai S， Elghazi L， Balcazar N， et al. Akt induces betacell proliferation by regulating cyclin D1， cyclin D2， and p21 levels and cyclindependent kinase4 activity［J］. Diabetes， 2006， 55(2): 318-325.

　　［7］CozarCastellano I， Takane KK， Bottino R， et al. Induction of βcell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenoviral delivery of cyclindependent kinase4 and cyclin D1［J］. Diabetes， 2004， 53(1): 149-159.