牦牛中性粒细胞防御素的分离纯化及抗菌活性

　　　　作者：董开忠， 余四九， 杨具田， 王冬梅， 蔡勇， 雒晓芳

【摘要】 　　目的: 分离牦牛中性粒细胞(PMN)防御素并检测其抗菌活性。方法: 运用Percoll密度梯度离心法， 从新鲜牦牛全血中分离纯化牦牛中性粒细胞， 用50 mL/L冰乙酸抽提， 提取液经BioGel P10聚丙烯酰胺凝胶过滤和反相高效液相色谱（RPHPLC）分离纯化， 对活性多肽进行质谱分析， 并对其中3个肽进行氨基酸组成分析， 用琼脂弥散法检测三种多肽的抗菌活性。结果: 获得13种活性多肽， 其中三个肽为牦牛中性粒细胞防御素1～3， 并具有很强的抗菌活性。结论: PMN存在防御素并具有广谱抗菌活性， 在天然免疫中发挥着重要作用。

【关键词】 牦牛; 分离纯化; 中性粒细胞; 防御素

　　［Abstract］AIM: To isolate and purify βdefensin from the neutrophils of Yak. METHODS: The method of percoll gradient centrifugation was employed to purify neutrophils from Yak peripheral blood. The crude extraction from Yak neutrophils was isolated respectively through a way of extractionion by 50 mL/L acetic acid， acid soluble extract of Yak neutrophils was obtained. Then it was further purified by BioGel P10 Polyacrylamide gel filtration and RPHPLC， and 9 out of 22 apices showed antibacterial activity. 9 apices showing antibacterial activity were selected to be analyzed by mass spectrograph.The antibacterial activities of the extracts from every step were analyzed by agarose radial diffusion assay. RESULTS: The molecular weight of the purifiedYak BNBD13 was determined to be 4.2， 4.6 and 4.8 kDa by mass spectrograph. BNBD13 from Yak neutrophils were able to effectively kill Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. CONCLUSION: Yak neutrophils have βdefensin which have broadspectrum antimicrobial activity， Yak defensin has an important part in innate immunit.

　　［Keywords］Yak; isolation and purification; neutrophils; βdefensin

　　防御素(defensins )是生物细胞特定基因编码的具有广谱抗微生物和细胞毒活性的多肽， 是机体天然免疫系统的重要组成成分， 广泛存在于各种动物［1， 2］、植物［3］和昆虫体内［4］， 是一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物多肽。根据防御素分子内半胱氨酸的位置和连接方式、 前体性质及表达位置的差异可分为α防御素、 β防御素、θ防御素、昆虫防御素和植物防御素五种类型。β防御素是Diamond等［5］于1991年首次在牛的气管黏膜上皮细胞中发现， 在哺乳动物的上皮细胞和嗜中性粒细胞内广泛表达。成熟的β防御素由38～42个氨基酸残基组成， 分子内含有6个保守的半胱氨酸， 序列中部有一个保守的脯氨酸和一个甘氨酸， 6个半胱氨酸形成三对由Cys1Cys5、Cys2Cys4、Cys3Cys6方式连接的二硫键［6］。研究表明防御素在体外对革兰阳性菌、 革兰阴性菌、分枝杆菌［7］、真菌［8］、部分被膜病毒［9］和肿瘤细胞等均具有很强的杀伤活性， 同时具有免疫激活、连接先天性免疫与获得性免疫［10］， 以及对炎症、创伤及神经损伤的修复等作用［11］。其作用研究已引起科研工作者的广泛关注。 牦牛是我国高原地区的特有动物资源品种之一， 具有耐氧、御寒、强抗病的生理特性。目前有关家畜、豚鼠、家兔和人的中性粒细胞防御素在国内外已有报道， 而对牦牛中性粒细胞（Polymorphonuclear， PMN）防御素的研究尚未见报道。本研究旨在从PMN分离出具有抗菌活性的小分子多肽， 并对其抗菌活性进行研究， 以便对其结构与功能进行更深入的研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　成年雄性牦牛由天祝藏族自治县回民屠宰场提供， 金黄色葡萄球菌 (ATCC25923) 、大肠杆菌(ATCC25922）、枯草芽孢杆菌(ADB403)均由本中心保存; Percoll分离液、三氟乙酸为Sigma产品， BioGel P10为BioRad Laboratories产品， 乙腈(Merck 公司)， 抗菌肽indolicidin(牛)购自美国肽公司， 冰醋酸(分析纯)为南京化学试剂厂产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PMN的获取

　　用无菌方法采集牦牛新鲜血液(EDTA抗凝)800 mL， 用比重1.086～1.115的Percoll密度梯度离心液分离全血中的中性粒细胞， 获取的多形核细胞层用等渗盐水洗涤3次后， 进行细胞计数并计算活细胞率。

　　1.2.2 牦牛中性粒细胞酸提取物的制备

　　将纯化的中性粒细胞在0.34 mol/L冷蔗糖溶液中匀浆， 然后将细胞匀浆液离心， 1500 r/min离心10 min， 沉淀物用上述蔗糖液洗涤并再次离心1～3次， 收集上清液。上清液经17 000 r/min， 4℃离心30 min， 淡黄色沉淀物即为中性粒细胞胞质内的颗粒组分。然后将中性粒细胞颗粒组分加入50 mL/L冰醋酸， 在2～4℃环境中搅拌过夜（18～24 h）， 之后经17 000 r/min， 4℃离心30 min， 收集上清液浓缩至相当于2.0×1012/L备用， 蛋白浓度约为30 g/L。冻干备用。

　　1.2.3 BioGel聚丙烯酰胺凝胶过滤纯化

　　将冷冻干燥的PMN提取物溶解于5 mL去离子水中， 根据A值调整稀释度， 使A为200， 上样于柱体积为2.6 cm×100 cm BioGel P10的层析柱， 用50 mL/L冰醋酸洗脱， 流速为0.2 mL/min， 280 nm紫外光监测吸光度， 收集活性峰测蛋白浓度后冷冻干燥， 4℃保存。

　　1.2.4 反相高效液相色谱（RPHPLC）的分离纯化

　　色谱柱Vydac C18柱(25 cm、1 cm)， 流动相A、B两液分别为1 mL/L三氟乙酸水溶液和1 mL/L三氟乙酸乙腈溶液， 流速3.0 mL/min， 235 nm， 280 nm同步监测并记录， 灵敏度1.5 A。把经过BioGel聚丙烯酰胺凝胶过滤分离收集的第3峰为样品， 在100% A时连续上样， 每次上样1000 μL， 共5次， 每次加样间隔约2 min， 待第5次上样之样品盐峰结束后， 用线性梯度洗脱收集主峰， 然后将纯化物以500 mg/L溶解在0.1 mL/L的乙酸中已备进一步纯化。

　　1.2.5 质谱分析

　　用英国VG公司的ZABHS质谱仪测定（由兰州大学分析测试中心测试）。

　　1.2.6 氨基酸的组成分析

　　随机选取RPHPLC分离后的抑菌活性第2峰进一步纯化， 将纯化样品通过日立L8800型全自动氨基酸分析仪进行氨基酸组成分析。

　　1.2.7 防御素抗菌活性的测定

　　取枯草芽孢杆菌(ADB403)、 金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、 大肠杆菌（ATCC25922）各加入LB 培养液中37℃过夜培养 (16～18 h)进行增菌， 当A600为0.6～0.8时用LB培养液1∶10 稀释， 取 0.1 mL加入 LB 琼脂平板上， 用灭菌涂布棒将菌液均匀涂布， 等菌液干后用灭菌琼脂打孔器打孔， 孔径为5mm， 分别于各孔内加入浓度为5、10、50、100 mg/L的防御素各10 μL， 并以生理盐水和同浓度抗菌肽indolicidin做对照， 将平板置于恒温培养箱内37℃培养18～24 h， 用卡尺测量抑菌圈的大小。

　　2 结果

　　2.1 牦牛防御素的分离纯化

　　2.1.1 BioGel凝胶过滤的分离效果

　　牦牛中性粒细胞酸提物经BioGel P10凝胶过滤出现3个峰（图1）。把经过BioGel P10凝胶过滤的峰收集物以金黄色葡萄球菌(ATCC25923)为实验指示菌进行抗菌活性测定， 结果表明第3峰为抑菌活性峰。

　　2.1.2 反相高效液相色谱（RPHPLC）纯化效果

　　中性粒细胞粗提物经过BioGel P10层析柱分离， 图中出现3个吸收峰， 将收集有活性的第3峰进一步用RPHPLC（C18）系统纯化， 共收集 22个峰， 用金黄色葡萄球菌作为实验指示菌进行抑菌活性测定， 有9个抑菌活性峰， 分别为第2、6、8、 10、11、12、14、18、19峰（图2）。

　　2.2 质谱测试分析

　　将9个抑菌活性峰收集物进行质谱分析， 测试出相对分子质量（M r）为4275、4645、4811 （第2峰）， 4762、4445（第6峰）， 4818、4552（第8峰）， 其余Mr为 4056（第10峰）、 4524（第11峰）、4506（第12峰）、4160（第14峰）、4103（第18峰）和4447（第19峰）， 共计13个多肽， Mr均在4 000～5 000之间， 完全符合防御素的大小。

　　2.3 氨基酸组成的分析

　　依据RPHPLC纯化洗脱时间顺序， 所得yBNBD13经测试分别有38、 40和42个氨基酸组成， 都含有6个Cys， 富含Arg、 Gly， 而且Ile和Pro含量也较高， 碱性氨基酸含量大于20%(表1)。表1 PMN防御素1～3的氨基酸组成（略）

　　2.4 抑菌活性检测结果

　　经琼脂弥散法对枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌进行体外抑菌活性检测， 结果表明yBNBD1～3对供试菌株都有很强的抑菌活性， 抗菌肽indolicidin对3种菌株都有较好的抗菌效果(图3)， 生理盐水对供试菌株无抑菌作用。

　　3 讨论

　　PMN是一种非特异性免疫防御前线细胞， 约占白细胞总数的70%。它主要通过胞内不依赖氧的杀菌物质与依赖氧的杀菌物质协同作用发挥防御功能。防御素是不依赖氧的杀菌物质之一， 具有广谱的抗菌活性和多种免疫调控功能。有效分离PMN防御素有助于对其结构和功能的研究。由于哺乳动物中性粒细胞内组分复杂有多种抗菌物质， 运用单一的层析分离法很难将其分离纯化， 所以科学选择综合应用分离防御素的色谱模式非常重要。本试验选择高分辩率的BioGel P10聚丙烯酰胺凝胶过滤层析基质， 其分离范围适于防御素的分离， 在进一步用反相高效液相色谱（RPHPLC）纯化， 有效分离纯化了PMN防御素。经试验表明这是一种有效分离纯化PMN防御素的方法， 该方法操作程序简单， 重复性好， 关键能保持防御素的活性， 是一种理想的分离纯化途径。

　　PMN酸提取物通过BioGel P10聚丙烯酰胺凝胶过滤和反相高效液相色谱（RPHPLC）后， 以金黄色葡萄球菌作为实验指示菌进行抑菌活性测定， 并进行质谱分析获得13种多肽， 且Mr在4 000～5 000之间。对其中3个肽进行氨基酸组成分析， 发现都含有6个保守的半胱氨酸， 精氨酸相对较丰富， 易溶于水， 耐热性好， Mr小， 对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌有很强的杀伤活性， 抗菌活性随着浓度的升高而增加， 并对革兰阴性菌抗菌效果更敏感， 因此可以确定这三种肽为牦牛中性粒细胞β防御素1～3。这也证实了中性粒细胞β防御素对革兰阴性菌的抗菌活性强于革兰阳性菌。对其结构及其他有活性的肽将有待进一步研究。
　　
　　随着临床上大量耐药菌株的出现， 使得全球对细菌感染性疾病的预防和治疗陷入困境， 研究和探索新型抗菌药物势在必行。防御素在抗菌机制方面具有传统抗生素无法比拟的优势， 因此防御素及其他抗菌肽将是较理想的新型抗菌药物， 同时也可作为免疫调节剂来调节机体免疫系统在感染中发挥的作用。本研究为筛选和应用优势的抗菌肽提供了理论依据， 并且丰富了哺乳动物防御素家族， 为进一步研究牦牛天然免疫作用奠定了基础。

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